鄭雪紅, 鄭愛榕

(廈門大學(xué) 海洋學(xué)系, 福建 廈門 361005)

氣相色譜法分析小球藻脂肪酸的組成

鄭雪紅, 鄭愛榕

(廈門大學(xué) 海洋學(xué)系, 福建 廈門 361005)

利用超聲波破碎技術(shù)在1 mol/L HCl-CH3OH溶液中提取小球藻脂肪酸并酯化, 并用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)其進(jìn)行定量和定性分析, 鑒定出 C14：0, C16：2, C16：1, C16：0, C18：2, C18：1, C18：3, C18：0,C20：0共 9種脂肪酸, 其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的 65%。6份平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 6.04%～9.84%, 樣品加標(biāo)回收率范圍為77.0%～122.6%, 各種脂肪酸甲酯的儀器檢測(cè)限＜0.3 ng。初步探討了脂肪酸甲酯在弱極性色譜柱上的保留時(shí)間規(guī)律。

小球藻; 脂肪酸; 氣相色譜; 氣質(zhì)聯(lián)用儀; 保留時(shí)間

海藻中含有大量有益于人體健康的生物活性物質(zhì), 其中的不飽和脂肪酸具有抗癌、抗菌、預(yù)防心血管疾病、養(yǎng)顏、健腦益智等功效[1-5], 可以增加動(dòng)物成活率和生長率, 被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料添加劑[6-7]。同時(shí), 海藻脂肪酸可以作為藻類的分類依據(jù)[8]、生物地球化學(xué)循環(huán)研究的生物標(biāo)志物[9]及生物柴油的原料[10]。目前, 很多學(xué)者開展了海藻脂肪酸研究[11-14],樣品前處理方法一般依次為皂化、酸化、萃取分離、濃縮、甲酯化、萃取分離、濃縮, 操作步驟多, 耗時(shí)長; 儀器分析多采用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用儀中的一種方法進(jìn)行定性和定量, 但實(shí)際上, 海藻中含有的脂肪酸種類非常復(fù)雜, 對(duì)于一些相同碳數(shù)的各種不飽和脂肪酸, 在色譜柱上的保留時(shí)間非常相近甚至重疊, 在定性時(shí)易出現(xiàn)誤判。氣質(zhì)聯(lián)用儀的長處在于提供豐富的離子碎片信息有利于定性, 但定量的準(zhǔn)確性不如氣相色譜。所以, 本文以我國近海常見的微藻種群之一小球藻為研究對(duì)象, 采用超聲波破碎、在HCl-CH3OH溶液中提取脂肪酸并酯化, 免去皂化、酸化逐步進(jìn)行的操作, 減少分離、濃縮的次數(shù), 分別用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定量和定性分析, 探討前處理步驟簡(jiǎn)化后方法的可行性, 歸納出脂肪酸甲酯的保留時(shí)間規(guī)律, 便于相同碳數(shù)脂肪酸相似組分的判定, 旨為海藻的開發(fā)利用研究提供更加簡(jiǎn)捷的分析手段與色譜分析的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

6890N氣相色譜儀(美國安捷倫公司); Saturn 2200 氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國瓦里安公司); SGD-300 氮、氫和空發(fā)生器(北京市精華苑技術(shù)研究所); 數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司); 超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。

飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)為國產(chǎn)分析純?cè)噭? 不飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)為美國Fluka公司色譜純?cè)噭? 甲醇和正己烷均為色譜純。

1.2 生物樣品

海水經(jīng)過濾滅菌, 添加f/2培養(yǎng)基及小球藻藻種,在自然光下培養(yǎng)。通過離心、洗滌、干燥、研磨, 獲得小球藻藻粉, 密封冷藏保存。

1.3 脂肪酸甲酯的制備

稱取約10 mg小球藻于水解管中, 加入62.4 μg正十九烷酸內(nèi)標(biāo), 加入2 mL 1mol/L HCl-CH3OH溶液, 充氮?dú)?min后密封, 超聲破碎 5 min, 然后在100 ℃水浴中抽提甲酯化40 min, 冷卻后用3 mL正己烷分3次萃取。合并提取液并用氮?dú)鉂饪s至1 mL,封口, 在冰箱中冷凍保存。按上述方法將脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)衍生為脂肪酸甲酯。所有樣品分別用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀分析。

1.4 氣相色譜分析條件

進(jìn)樣口溫度280 , ℃不分流進(jìn)樣, 進(jìn)樣量1 μL, 采用 HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm), 載氣高純氮, 流量為1 mL/min, FID檢測(cè)器溫度為300 , ℃尾吹氮?dú)?、氫氣和空氣流量分別為25、30和400 mL/min。升溫程序?yàn)椋?在120 ℃恒溫1 min, 以20 /min℃升到210 , ℃恒溫10 min, 以6 /min℃升到250 , ℃恒溫3 min, 以30 /min℃升到280 , ℃恒溫6 min。

1.5 氣質(zhì)聯(lián)用儀分析條件

進(jìn)樣口溫度、進(jìn)樣模式、進(jìn)樣量、載氣流量、升溫程序同氣相色譜分析條件, 采用與HP-5極性等同的 VF-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm), 載氣高純氦, 傳輸線溫度280, ℃離子阱溫度180, ℃用電子轟擊 EI-Auto電離模式分析, 電子轟擊能量70 eV, 質(zhì)荷比掃描范圍40～650。

1.6 定性和定量方法

以正十九烷酸為內(nèi)標(biāo), 采用色譜相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜定性, 利用相對(duì)校正因子按內(nèi)標(biāo)法定量。每種脂肪酸的含量用質(zhì)量比(mg/g, 干質(zhì)量)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻脂肪酸組成

各種脂肪酸甲酯的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)校正因子如表1所示。圖1是標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯和小球藻脂肪酸甲酯的氣相色譜圖, 有兩組脂肪酸甲酯共餾出,分別是 C18：1 和 C18：3、C20：1 和 C20：3, 其他脂肪酸甲酯得到較好的分離。通過質(zhì)譜鑒定(圖 2), 發(fā)現(xiàn)小球藻中含有順-9,12-十六碳二烯酸(C16：2)。

小球藻脂肪酸的組成及含量見表 2, 共鑒定出C14：0, C16：2, C16：1, C16：0, C18：2, C18：1、C18：3,C18：0, C20：0共9種脂肪酸, 其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的 65%, 飽和脂肪酸以 C16：0和 C20：0為主,這與[15,16]的研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)、程遠(yuǎn)月等[16]及Georgi和Guillermo[17]均未在小球藻中檢測(cè)到C20及C22系列的不飽和脂肪酸, 而廖啟斌等[18]和王明清等[12]報(bào)道小球藻中 C20：5含量高達(dá) 26.3%和 27.3%,呂冬偉等[14]的研究表明 C20：5含量為 13%, 這可能與微藻培養(yǎng)條件的差異有關(guān), 或是小球藻受到其他藻種、細(xì)菌的影響[17]。

表1 脂肪酸甲酯的相對(duì)保留時(shí)間(RRT)、相對(duì)校正因子(RRF)及儀器檢測(cè)限Tab. 1 Relative retention time (RRT), relative rectification factor (RRF) and limit of detection for instrument of fatty acid methyl esters

圖1 標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯(a)和小球藻脂肪酸甲酯(b)的氣相色譜圖Fig. 1 Gas chromatograms of fatty acid methyl esters for standard (a) and algae Chlorella (b)(1. C14：0, 2. C16：1, 3. C16：0, 4. C18：2, 5. C18：1+C18：3, 6. C18：1trans, 7. C18：0,8. C19：0, 9. C20：4,10. C20：5, 11. C20：1+C20：3, 12. C20：1trans, 13. C20：0, 14. C22：6,15. C22：1, 16. C22：0, 17. C24：1,18. C24：0, 19. C16：2)

圖2 小球藻中順-9,12-十六碳二烯酸甲酯(C16：2)質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of cis-9,12-hexadecadienoic acid methyl ester in algae Chlorella

表2 小球藻脂肪酸組成Tab. 2 Composition of fatty acids in algae Chlorella

2.2 儀器檢測(cè)限

脂肪酸甲酯標(biāo)樣稀釋后用氣相色譜分析, 計(jì)算3倍信噪比時(shí)的標(biāo)樣質(zhì)量, 得到的儀器檢測(cè)限如表 1所示, 各種脂肪酸甲酯的檢測(cè)限為 0.02～0.29 ng,

說明儀器具有很好的靈敏度。

2.3 儀器精密度

取一份經(jīng)抽提并甲酯化衍生的小球藻樣品, 在氣相色譜上重復(fù)進(jìn)樣 6次, 各組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在 0.29%～5.34%之間(表 3), 說明儀器的精密度良好。

2.4 方法精密度

對(duì)同一小球藻樣品, 平行稱取6份, 經(jīng)抽提甲酯化后用氣相色譜分析, 其結(jié)果如表4所示。6份平行樣品中各種脂肪酸甲酯的RSD為6.04%～9.84%, 說明方法的精密度良好。

2.5 加標(biāo)回收率

稱取約10mg藻粉3份, 分別加入低、中、高三種質(zhì)量水平的各種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn), 經(jīng)抽提甲酯化后用氣相色譜分析, 其回收率范圍分別為 77.0%～111.7%、78.8%～116.8%、86.9%～122.6%(表5), 說明該方法的回收率較好。

2.6 脂肪酸甲酯的保留時(shí)間規(guī)律

從表1可以看出, 脂肪酸甲酯在HP-5這種弱極性柱上的保留時(shí)間規(guī)律為： (1)保留時(shí)間與脂肪酸的碳數(shù)成正比, 即碳數(shù)越大, 保留時(shí)間越長; (2)從C18、C20和C22系列脂肪酸甲酯的相對(duì)保留時(shí)間可以看出, 對(duì)于相同碳數(shù)的各種脂肪酸甲酯, 飽和脂肪酸最后出峰, 雙鍵數(shù)目越多, 保留時(shí)間越短, 同時(shí)雙鍵數(shù)目為偶數(shù)的脂肪酸甲酯早于雙鍵數(shù)目為奇數(shù)的脂肪酸甲酯出峰; (3)同一種脂肪酸甲酯, 順式脂肪酸甲酯先出峰, 反式脂肪酸甲酯后出峰。根據(jù)上述

規(guī)律, 有利于在標(biāo)準(zhǔn)品種類不足或缺乏質(zhì)譜定性時(shí)對(duì)脂肪酸組分進(jìn)行推斷。

表3 重復(fù)6次進(jìn)樣的分析結(jié)果(mg/g, 干質(zhì)量)Tab. 3 Results of six injections for one sample (mg/g, dry weight)

表4 小球藻平行樣測(cè)定結(jié)果(mg/g, 干質(zhì)量)Tab. 4 Results of six parallel samples for algae Chlorella (mg/g, dry weight)

表5 小球藻樣品加標(biāo)回收率結(jié)果Tab. 5 Recoveries for spiked standards in samples

3 結(jié)論

建立了小球藻脂肪酸超聲波破碎、抽提與甲酯化同時(shí)進(jìn)行的前處理方法及氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用儀的分析方法, 大部分脂肪酸甲酯得到較好的分離并經(jīng)過質(zhì)譜準(zhǔn)確定性。各種脂肪酸甲酯的儀器檢測(cè)限均小于 0.3ng, 實(shí)際樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 6.04%～9.84%, 加標(biāo)回收率77.0%～122.6%, 具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等特點(diǎn), 可滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。實(shí)驗(yàn)推斷出的脂肪酸甲酯保留時(shí)間規(guī)律, 為脂肪酸的色譜分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Determination of fatty acids in algae Chlorella by gas chromatography

ZHENG Xue-hong, ZHENG Ai-rong
(Department of Oceanography, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Mar.,1,2012

Algae Chlorella; Fatty acids; Gas chromatography; Gas chromatography/mass spectrometry; Retention time

A shortcut method to analyze fatty acids in marine algae quickly and easily was reported in the paper.The ultrasonic extraction was used in the pretreatment of algae Chlorella, then the fatty acids were converted to fatty acid methyl esters by 1 mol/L HCl-CH3OH. The composition of fatty acid methyl esters was analyzed with gas chromatography and gas chromatography/mass spectrometry. Nine fatty acids including C14：0, C16：2, C16：1,C16：0, C18：2, C18：1, C18：3, C18：0, C20：0 were found and the unsaturated fatty acids was 65% of total. The relative standard deviations of six parallel samples were 6.04%～9.84%. The recoveries for spiked standards in samples were 77.0%～122.6%. The limits of detection for instrument were below 0.3 ng. The rule of retention time for fatty acid methyl ester was investigated. This method is very simple, quick and accurate and could be used in practical application.

0657.71; P734.5

A

1000-3096(2012)06-0022-06

2012-03-01;

2012-03-20

國家教育部高等學(xué)校骨干教師計(jì)劃基金資助項(xiàng)目; 廈門大學(xué)預(yù)研基金資助項(xiàng)目(B類 2003xdyy40); 國家海洋局公益性項(xiàng)目(201005012)

鄭雪紅(1977-), 福建龍巖人, 工程師, 研究方向： 從事海洋化學(xué)領(lǐng)域研究及色譜儀的功能開發(fā), 電話： 0592-2186493 , E-mail：xhzheng@xmu.edu.cn

(本文編輯：康亦兼)