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        火龍果莖段組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

        2012-10-22 07:25:56王云山周美虹康黎芳曹冬梅段九菊
        山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年5期
        關(guān)鍵詞:莖段外植體火龍果

        王云山,周美虹,康黎芳,曹冬梅,張 超,段九菊

        (1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,山西太原030031;2.太原市迎澤李園農(nóng)業(yè)科技培育場(chǎng),山西太原030045)

        火龍果(Hylocereus undatus)又稱紅龍果、仙蜜果,屬仙人掌科三角柱屬,原產(chǎn)于墨西哥等中美洲地區(qū),是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和保健美容作用的新興水果[1]?;瘕埞仓隇槎嗄晟赓|(zhì)植物,花蕾似漏斗,一般于傍晚開花,凌晨逐漸凋萎。自花授粉,但坐果率低,因此,一般采用人工授粉。不同品種的火龍果果肉顏色不同,有白色、紅色、黃色、紫紅色等,而且營養(yǎng)價(jià)值極高,含有豐富的維生素、纖維素、葡萄糖及人體所需K,Ca,Mg等多種礦物質(zhì)、蛋白質(zhì),但脂肪含量較少[2-3]。另外,火龍果耐旱、耐瘠薄,抗性強(qiáng),能夠在旱坡地種植,具有保持水土、減少沙化、改善生態(tài)環(huán)境的作用[4-5]。因此,其在生產(chǎn)上具有較大的發(fā)展前途及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

        目前,火龍果的繁殖主要通過種子、扦插、嫁接等方式,這些方法的繁殖速度較慢,又受繁殖材料供應(yīng)的限制,很難滿足市場(chǎng)的需求。近年來,科研工作者一直嘗試用組織培養(yǎng)的方式繁殖火龍果[6-14],且已取得了一定的成效。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,探索用火龍果幼嫩莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),以達(dá)到快速繁殖的目的,從而實(shí)現(xiàn)火龍果的工廠化生產(chǎn)。

        1 材料和方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        試驗(yàn)以火龍果幼嫩莖段作為外植體,供試材料于2010年7月取自太原市迎澤李園農(nóng)業(yè)科技培育場(chǎng)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 外植體的取材 從溫室中生長(zhǎng)健壯的火龍果母株上,剪取 2~3,5~7,15~17 cm共 3種長(zhǎng)度的帶刺座幼嫩莖段作為外植體,觀察不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)以及刺座不定芽萌發(fā)的影響。

        1.2.2 外植體的滅菌 剪取生長(zhǎng)健壯的母莖上的新生莖段,在洗衣粉液中用軟毛刷刷洗并用流水沖洗干凈,然后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)用鑷子小心剝?nèi)ゴ套系男〈毯兔?,之后?5%的酒精快速消毒30 s,然后將莖段置于0.1%的升汞溶液中浸泡消毒。其中,流水沖洗時(shí)間設(shè)0.5,1 h 2個(gè)處理,0.1%的升汞溶液消毒時(shí)間設(shè)7,10,15 min共3個(gè)處理,組成6個(gè)組合。表面消毒完成后用無菌水沖洗4次,每次5 min左右。消毒過程中要攪拌外植體,使其充分接觸消毒液,提高消毒效果。將消毒后的莖段橫切成1.5 cm左右長(zhǎng)的莖段,基部向下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1周后,統(tǒng)計(jì)其污染率和褐死率。

        1.2.3 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 沿波浪形棱緣縱向切成長(zhǎng)×寬為1.5 cm×1.5 cm、帶有刺座的小塊(去除髓部及藥劑接觸過的傷口),每塊上均留有1個(gè)刺座,垂直接種在培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的6-BA和NAA,蔗糖30 g/L,瓊脂5 g/L,pH值為5.8。6-BA質(zhì)量濃度分別為 2,4,5,8,10 mg/L,共 5 個(gè)水平;NAA分別為 0.05,0.1,0.2 mg/L共 3個(gè)水平,共計(jì)15個(gè)處理。

        每個(gè)處理10瓶,每瓶2塊,培養(yǎng)45 d,統(tǒng)計(jì)其刺座不定芽的誘導(dǎo)率。培養(yǎng)室溫度為(25±3)℃,每天光照 12 h,光照強(qiáng)度 1 500~2 000 lx。

        1.2.4 分化增殖培養(yǎng)基篩選 將誘導(dǎo)出的不定芽切成3~5個(gè)芽作為一叢(大小、長(zhǎng)勢(shì)要一致),接種于分化增殖培養(yǎng)基上,進(jìn)行不定芽分化增殖?;九囵B(yǎng)基為MS,瓊脂為5 g/L,蔗糖30 g/L,激素 6-BA 質(zhì)量濃度為 1.0,3.0,5.0,8.0 mg/L,共4個(gè)水平;激素NAA質(zhì)量濃度為0.05,0.1,0.2 mg/L,共3個(gè)水平。合計(jì)12個(gè)處理。

        每個(gè)處理5瓶,每瓶3塊,培養(yǎng)30 d,統(tǒng)計(jì)其刺座不定芽的增殖率。

        1.2.5 生根培養(yǎng)基篩選 取同一增殖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)健壯、高達(dá)2 cm以上的小苗接種到生根培養(yǎng)基中,生長(zhǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其生根情況?;九囵B(yǎng)基為:大量元素減半的1/2 MS,瓊脂5 g/L,蔗糖30 g/L。IBA質(zhì)量濃度分別為 0.3,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0 mg/L,共7個(gè)水平;NAA質(zhì)量濃度分別為0.5,2.0 mg/L,共2個(gè)水平。為了研究活性炭對(duì)生根褐化的影響,另加1個(gè)IBA 1.0 mg/L+活性炭2 g/L的處理,共10個(gè)處理。

        每個(gè)處理5瓶,每瓶3~6塊。生長(zhǎng)30 d觀察其生根情況。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同滅菌方法對(duì)火龍果外植體的影響

        從表1可以看出,以火龍果母莖上的新生莖段為材料,用0.1%的升汞消毒15 min的污染率最低,但消毒15 min的材料大部分刺座及莖棱組織有褐化并逐漸壞死的現(xiàn)象,說明15 min的消毒時(shí)間過長(zhǎng),莖段的組織細(xì)胞被殺死。這與周傳明等[15]報(bào)道的火龍果外植體在不同消毒時(shí)間過程中的現(xiàn)象是一致的。綜合考慮,材料滅菌以流水沖洗0.5 h+75%酒精消毒30 s+0.1%的升汞消毒10 min處理最佳。

        表1 不同滅菌方法對(duì)火龍果外植體的影響

        2.2 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及刺座不定芽萌發(fā)的影響

        從表2可以看出,不同長(zhǎng)度的帶刺座棱片均能產(chǎn)生愈傷組織,刺座上的不定芽大部分可以啟動(dòng)生長(zhǎng),但有差異,其中,以2~3 cm長(zhǎng)的幼嫩莖段誘導(dǎo)效果最佳。外植體接種1周后,切口變厚,切口處產(chǎn)生疏松的淡綠色愈傷組織,20 d后切口表面突起呈半球狀,形成綠色愈傷組織。刺座則在10~14 d后長(zhǎng)出帶有白色茸毛的小突起,20~30 d后不定芽萌出,形成一個(gè)類似鹿角狀的組織。

        表2 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及刺座不定芽萌發(fā)的影響

        2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)火龍果外植體刺座不定芽誘導(dǎo)分化的影響

        本研究采用的誘導(dǎo)火龍果刺座不定芽分化的激素組合為6-BA和NAA,其不同質(zhì)量濃度組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)分化的影響如表3所示。

        從表3可以看出,火龍果在MS附加不同質(zhì)量濃度的 6-BA(2~10 mg/L)和 NAA(0.05~0.2 mg/L)的培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)刺座產(chǎn)生不定芽。在本試驗(yàn)條件下,當(dāng)較高質(zhì)量濃度的6-BA(4~8 mg/L)與適宜質(zhì)量濃度NAA組合(處理4~8,10,11)時(shí),外植體刺座不定芽誘導(dǎo)率較高,達(dá)50%~75%;當(dāng)較低質(zhì)量濃度的6-BA(2 mg/L)與 NAA(0.05~0.2 mg/L)組合(處理 1,2,3)時(shí),刺座不定芽分化率較低,僅為5%~25%。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度相同、6-BA質(zhì)量濃度降低,或6-BA質(zhì)量濃度相同、NAA質(zhì)量濃度提高時(shí),大部分表現(xiàn)為不定芽分化率下降。綜上所述,不同的激素質(zhì)量濃度組合對(duì)火龍果刺座不定芽的誘導(dǎo)效果不同,以4 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA組合時(shí)效果最好,其刺座不定芽分化率最高,可達(dá)到75%。

        表3 不同培養(yǎng)基對(duì)火龍果刺座芽誘導(dǎo)分化的影響

        2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)芽增殖與生長(zhǎng)的影響

        由表4可知,當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為8 mg/L,NAA質(zhì)量濃度為0.05 mg/L(處理10)時(shí),不定芽的繁殖系數(shù)最高,達(dá)6.0,但其不定芽生長(zhǎng)緩慢,呈細(xì)弱狀,且褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L,NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí),雖然不定芽的繁殖系數(shù)低,但其不定芽生長(zhǎng)較快、苗壯。在NAA質(zhì)量濃度相同時(shí),隨6-BA質(zhì)量濃度的增加,芽的繁殖系數(shù)隨之增加,同時(shí)不定芽生長(zhǎng)減緩,長(zhǎng)勢(shì)減弱且褐化嚴(yán)重。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度相同,NAA質(zhì)量濃度提高時(shí),不定芽繁殖系數(shù)則下降,氣生根增多。

        在繼代過程中,可以根據(jù)生產(chǎn)的需要先在6-BA 8 mg/L+NAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)7~10 d,待刺座上長(zhǎng)出許多小突起,再轉(zhuǎn)接于6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)。這樣交替培養(yǎng),可以調(diào)節(jié)不定芽的增殖與生長(zhǎng),從而達(dá)到既有較快的繁殖速度,又能保證有較好的小苗且減少褐化苗的目的。

        表4 不同培養(yǎng)基對(duì)芽增殖與生長(zhǎng)的影響

        2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)火龍果生根的影響

        從表5不同培養(yǎng)基對(duì)火龍果生根的影響可以看出,IBA在0~3 mg/L范圍內(nèi),生根率和生根數(shù)隨著濃度的升高而提高,尤其以1/2 MS+I(xiàn)BA 2.0 mg/L處理的生根效果最好,生根率為86.96%,平均每株生根數(shù)5條。培養(yǎng)7~10 d開始有氣生根生出。當(dāng)IBA質(zhì)量濃度達(dá)4.0 mg/L時(shí),對(duì)根的形成起抑制作用。結(jié)果還表明,IBA的生根效果比NAA好。添加活性炭(處理4)雖可減輕根的褐化,但與處理3相比,抑制了生根,因此,活性炭對(duì)生根沒有益處。

        表5 不同培養(yǎng)基對(duì)火龍果生根的影響

        3 結(jié)論與討論

        外植體表面滅菌的關(guān)鍵是選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間,而消毒劑中,以升汞的殺菌能力最強(qiáng)、最常用,但它對(duì)外植體的傷害也最大,不易去除。消毒時(shí)間太長(zhǎng),外植體吸入升汞量較多,輕者會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生毒害,抑制細(xì)胞分裂和新陳代謝,使芽苗生長(zhǎng)減弱,重者會(huì)使外植體中毒死亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明,火龍果幼嫩莖段的滅菌以流水沖洗0.5 h+75%酒精30 s+0.1%升汞10 min處理最佳。污染多數(shù)在芽眼的叢刺處出現(xiàn),這是由火龍果莖段芽眼處有成叢的葉刺,外植體不易清洗干凈,消毒劑也較難透入,滅菌不徹底造成的。

        在組織培養(yǎng)過程中,芽苗的發(fā)育受到細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例高低的調(diào)控,細(xì)胞分裂素能誘導(dǎo)不定芽形成,削弱頂端優(yōu)勢(shì),促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā);而生長(zhǎng)素能促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng),加強(qiáng)頂端優(yōu)勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素濃度比例適當(dāng)時(shí),二者能互相協(xié)同作用,有利于不定芽的形成。

        本試驗(yàn)結(jié)果表明,不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L最佳。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為8 mg/L和NAA質(zhì)量濃度為0.05 mg/L時(shí),不定芽的繁殖系數(shù)最高;當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L和NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí),不定芽生長(zhǎng)較快、苗壯,因此,可以根據(jù)生產(chǎn)的需要交替使用這2種培養(yǎng)基。適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+I(xiàn)BA2.0 mg/L。

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