張金鈴，崔 巍，吉長福，崔山佳，孫海舒，張守信，蔣 瑾，羅明富、4△

(1.中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京 100700;2.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院北京北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029;3.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700)

胃潰瘍的患病率為5% ～10%［1-2］，目前西醫(yī)治療主要采用殺滅幽門螺旋桿菌及抑制胃酸等措施，近期效果好，停藥后復發(fā)率高［3］且副作用多，價格貴。針灸治療該病副作用小，有廣泛的治療應用前景，但機制尚不明確，故本實驗就針與灸治療胃潰瘍模型大鼠的異同為切入點，進一步摸索針灸作用的機理。通過細胞培養(yǎng)及活細胞內(nèi)游離鈣離子Fluro-3分子探針標記，觀察針與灸的細胞分子水平作用機制，從而分析肥大細胞的功能活動與針灸作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 造模

大鼠損傷性胃潰瘍模型制備方法的具體操作:注射器去針頭，在連接針頭處安裝細銅管，將配制好的HCL吸入注射器中，銅管沿大鼠食管插入胃中后緩慢推入藥物，用于造成胃黏膜急性損傷。

1.2 制備血清

血清的無菌操作制備改良方法:將大鼠腹主動脈暴露，選取普通型10ml靜脈取血管，將靜脈針插入腹主動脈后，按住末端插入無菌一次性取血管取血，靜置40min后離心吸取血清到無菌管中，凍存于－20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 針與灸的施治方法

取足三里和胃腧穴;電針1mA，頻率2/15Hz，每次20min，連續(xù)3d;艾灸同樣取足三里和胃腧穴每次每穴2柱，連續(xù)3d。

1.4 分組

實驗分為正常對照組、胃潰瘍模型組、針刺模型組、艾灸模型組4組。取4組大鼠血清分別加入培養(yǎng)的肥大細胞皿中，作用12h和24h后，采用Fluro-3分子探針標記，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子的熒光值變化，從而動態(tài)分析探索針灸穴位作用于經(jīng)絡皮部的機制。

2 結(jié)果

2.1 針與灸血清作用于培養(yǎng)的肥大細胞12h后的效應觀察

表1顯示，加入模型組血清后細胞內(nèi)熒光值升高，與正常組比較差異有顯著性(P＜0.01)，可見潰瘍使細胞內(nèi)鈣離子升高，出現(xiàn)了鈣超載的現(xiàn)象，模型成功。而針刺組與模型組比較，肥大細胞內(nèi)熒光值明顯下降(P＜0.01)，說明針刺潰瘍模型大鼠細胞內(nèi)鈣離子濃度沒有上升;艾灸組與模型組比較差異顯著(P＜0.01)，說明潰瘍大鼠施艾灸后，肥大細胞內(nèi)未出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象。艾灸與針刺差異不顯著。

2.2 針與灸血清對肥大細胞作用24h后的效應觀察

表2顯示，加入血清24h后，模型組與正常組比較未見明顯差異(P＞0.05)，針刺組和艾灸組與模型組比較差異亦不顯著，說明針與灸血清24h時對肥大細胞沒有表現(xiàn)出調(diào)節(jié)作用，針灸作用可能有時間窗口限制。

表1 加入針與灸血清12h對培養(yǎng)肥大細胞鈣超載的阻抑作用(珋x±s)

表2 針與灸血清加入24h后對培養(yǎng)肥大細胞內(nèi)鈣含量的調(diào)節(jié)作用(珋x±s)

3 討論

RBL-2H3是1978年美國國立牙科研究所的免疫學實驗室從Wistar大鼠嗜堿性細胞中分離和克隆出來的細胞株。這些細胞具有高親和力的IgE受體。通過集聚這些受體或與鈣離子載體協(xié)同作用可以激活它們分泌組胺及其他遞質(zhì)。這株細胞廣泛地用于研究細胞分泌的不同方面，包括細胞內(nèi)鈣濃度改變、磷酸脂酶激活、蛋白激酶和小 G蛋白的作用［4、5］。肥大細胞作為效應細胞一旦被激活即釋放其預先合成和新產(chǎn)生的介質(zhì)如組胺、IL-4等細胞因子，從而在生理和病理條件下參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分泌和遷移等。有研究顯示，IL-12不能刺激肥大細胞分泌IL-6，但能通過激活ERK信號傳導通路實現(xiàn)刺激肥大細胞分泌 IL-13［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，肥大細胞胞質(zhì)鈣離子濃度升高并持續(xù)穩(wěn)定在最大值平臺時能夠獲得最佳的脫顆粒率。也就是說，細胞內(nèi)鈣離子升高后可促使肥大細胞脫顆粒。電針和手針實驗同樣發(fā)現(xiàn)肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象［8、9］。穴位區(qū)肥大細胞參與了激光針灸鎮(zhèn)痛效應，而肥大細胞的脫顆?，F(xiàn)象是產(chǎn)生此效應的一個重要環(huán)節(jié)，肥大細胞可由不同途徑激活而產(chǎn)生相似效應［10］。本課題采用體外培養(yǎng)活細胞的方法，研究針灸作用后的組織液血清直接作用于培養(yǎng)的肥大細胞并觀察鈣離子的變化，從而直觀地探討針灸的作用機制是否為通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度來發(fā)揮功能。

熒光分子探針Fluo-3AM是以鈣的螯合劑EDTA為基礎合成的，其乙酰羥甲基酯(AM)形式無熒光，游離態(tài)也無熒光。Fluo-3AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料，F(xiàn)luo-3AM的熒光非常弱，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3AM進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內(nèi)。Fluo-3AM可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合后熒光強度可增強50～100倍，因此Fluo-3AM可以反映出鈣離子濃度。既往神經(jīng)細胞實驗表明，其可作為顯示細胞內(nèi)鈣離子濃度的理想標記物［10、11］。Fluo-3AM 的常用濃度為 0.5～5μmol/L，通常用含有0.5～5μmol/L的 Fluro-3AM溶液和細胞一起于20℃ ～37℃孵育15min進行熒光探針裝載。隨后適當洗滌，洗滌后可以考慮適當再孵育以確保分子探針在細胞內(nèi)完全轉(zhuǎn)變成Fluro-3，然后在流式細胞儀上進行檢測。每個樣本檢測10000個狀態(tài)良好的活細胞，以增加結(jié)果的可靠性與穩(wěn)定性。

近來文獻報道，肥大細胞敏化后，刺激細胞內(nèi)鈣釋放和細胞外鈣離子內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，會引起細胞膜通透性增加，進一步引起細胞脫顆粒、合成細胞因子并釋放引起周圍組織和器官發(fā)生炎癥反應［12～14］。肥大細胞(MC)是Ⅰ型變態(tài)反應速發(fā)相的主要靶細胞，也是Ⅰ型變態(tài)反應性炎癥的主要啟動細胞［14］?？梢姡蚀蠹毎拿擃w粒反應是機體的一種防御反應，也是速發(fā)型變態(tài)反應和炎癥等病理反應的基礎［15］。然而肥大細胞脫顆粒釋放的炎癥因子又可激活臨近的肥大細胞脫顆粒，啟動脫顆粒的自身放大機制［15、16］，引起更大范圍的炎癥反應，它的過度應激會導致組織損傷。本實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)的肥大細胞加入損傷性胃潰瘍模型大鼠血清12h后，細胞內(nèi)游離鈣離子升高，可能是損傷性胃潰瘍大鼠的血清中含有某些應激活性因子，促使細胞內(nèi)鈣離子升高，從而引起肥大細胞脫顆粒等反應。而針與灸作用于損傷性胃潰瘍模型大鼠后，使血清中產(chǎn)生了某種分子拮抗胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，從而抑制細胞膜通透性增加的通路，阻抑了肥大細胞脫顆粒的自放大功能，減輕過度炎癥反應。但是加入血清24h后，針與灸血清的阻抑肥大細胞內(nèi)鈣離子升高的作用沒有發(fā)揮出來，說明針與灸的作用可能有時間窗口限制。

本實驗通過血清學方法深入探索活細胞狀態(tài)下針灸對離體肥大細胞內(nèi)鈣離子的效應規(guī)律，直觀地探索針灸的肥大細胞內(nèi)鈣通路效應機理，對揭示針與灸的細胞內(nèi)鈣信號作用通路提供了物質(zhì)基礎，對進一步解釋經(jīng)絡實質(zhì)及經(jīng)穴組織物質(zhì)激活路徑及物質(zhì)交換機理有重要意義。

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