柴 旺，何小鵑，朱軍璇，呂 誠，趙宏艷，呂愛平，喻長遠△

(1.北京化工大學，北京 100029;2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700;3.西南交通大學，成都 610031;4.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700)

中藥材黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，具有升陽固表、補中益氣、托毒生肌、利水退腫之功效，黃芪多糖是黃芪中重要的有效活性成分［1］。目前研究結果表明，黃芪多糖能夠有效提高機體的非特異性和特異性免疫功能，并可通過調節(jié)整體細胞免疫功能、誘導腫瘤細胞凋亡、調節(jié)具有殺傷腫瘤細胞的細胞因子等方面，對腫瘤細胞的生長產生抑制作用［2］。近年來，黃芪多糖抗腫瘤免疫機制的研究主要集中在激活和促進樹突狀細胞、巨噬細胞以及輔助性T細胞轉化等方面，但對髓樣抑制細胞(MDSC)調節(jié)和影響方面的研究較少［3］。為此，本實驗擬以B16-F10荷瘤小鼠作為研究對象，通過觀察黃芪多糖對荷瘤鼠髓樣抑制細胞免疫活性的影響，探討黃芪多糖在抗腫瘤免疫機制方面所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性 C57BL/6小鼠，體重 20g～22g，50只(中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物許可證 SCXK-(軍)2007-004);黑色素瘤B16-F10細胞株(中國科學院上海生命科學研究院);RPMI1640培養(yǎng)基(美國 Gibcol公司);胎牛血清(美國 Gibcol公司);雙抗(美國 Sigma公司);0.05%胰蛋白酶 +0.25%乙二胺四乙酸(0.05%trypsin+0.25%EDTA)(美國 Gibcol公司);磷酸鹽緩沖液(PBS，北京中杉金橋生物技術有限公司);注射用環(huán)磷酰胺環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);黃芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS，天津賽諾制藥有限公司);FITC anti-mouse Ly-6G/Ly6c(Gr-1)抗體(BioLegend公司);PE anti-mouse CD11b抗體(BioLegend公司);Mouse IL-10 platinum ELISA(eBioscience公司);Mouse VEGF-A platinum ELISA(eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 B16-F10 細胞培養(yǎng) B16-F10(小鼠黑色素瘤)細胞株，消化液(0.05%trypsin+0.25%EDTA)消化后，傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)環(huán)境:RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%FBS)，37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱。采用對數生長期的B16-F10細胞用于實驗。

1.2.2 B16-F10荷瘤鼠模型的建立 將50只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組、環(huán)磷酰胺組(CTX)、黃芪多糖組、黃芪多糖 +CTX組5組。造模方法:將生長對數期的B16-F10細胞，調整細胞濃度為 4×106個/mL，以每只 0.1mL接種于C57BL/6小鼠右側背部皮下。造模后第2天開始給藥。正常組和模型組:生理鹽水，0.2mL/只灌胃給藥;CTX 組:10mg/kg，0.2mL/只腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給藥7d;黃芪多糖組:150mg/kg，0.2mL/只灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥14d;黃芪多糖 +CTX組:按150mg/kg黃芪多糖 每只0.2mL灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥14d，同時按10mg/kg CTX，每只0.2mL腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給藥7d。每3d稱量各組小鼠腫瘤大小。第15天處死全部小鼠。采取眼球取血法，收集 C57BL/6小鼠血液，600g離心20min，收集血清，于-80℃低溫冰箱保存;脫頸處死小鼠，取脾臟制備單細胞懸液，用于流式細胞術檢測;取腫瘤，根據公式“抑瘤率 =(生理鹽水對照組瘤體稱重－藥物組瘤體稱重)÷生理鹽水對照組瘤體稱重×100%”，計算抑瘤率。

1.2.3 流式細胞術檢測脾臟 Gr-1+CD11b+髓樣抑制細胞比例 將脾臟剪碎用200目濾布過濾，1000r/min離心8min。將所得細胞加入2mL裂紅液進行破紅，1min后加入 PBS終止。選擇1100r/min離心8min。調整細胞懸液濃度為1×107個/mL，取出100μL至EP管，用 PBS洗滌2次后，將細胞重懸于100μLPBS中，加入 FITC anti-mouse Ly-6G/Ly6c(Gr-1)抗體和PE anti-mouse CD11b抗體，避光4℃孵育30min。再用PBS洗滌細胞3次，最后將細胞重懸于500μLPBS中，上機檢測 Gr-1+CD11b+髓樣抑制細胞比例。

1.2.4 酶聯免疫吸附試驗檢測血清 IL-10、VEGF含量 使用eBioscience公司的IL-10(白介素-10)、VEGF(血管內皮細胞生長因子)ELISA試劑盒檢測小鼠血清中IL-10、VEGF含量。測定方法分別參照對應試劑盒上的說明進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數據以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 黃芪多糖對B16-F10荷瘤小鼠抑瘤率的影響

黃芪多糖和CTX均能顯著抑制荷瘤鼠腫瘤生長。CTX、黃芪多糖、黃芪多糖+CTX組的抑瘤率分別為 68.73% 、75.2% 、79.78% 。

2.2 黃芪多糖對脾臟 Gr-1+CD11b+髓樣抑制細胞的影響

表1顯示，與正常組相比，模型組的脾臟Gr-1+CD11b+髓樣抑制細胞比例顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，CTX、黃芪多糖、黃芪多糖+CTX治療均可以顯著降低脾臟Gr-1+CD11b+髓樣抑制細胞比例(P＜0.01)。

表1 黃芪多糖對脾臟Gr-1+CD11b+髓樣抑制細胞的影響

2.3 黃芪多糖對 B16-F10荷瘤鼠血清 IL-10、VEGF含量的影響

表2顯示，與正常組相比，模型組的荷瘤鼠血清中分泌的IL-10和VEGF顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，CTX組、黃芪多糖組、黃芪多糖+CTX組的B16-F10荷瘤鼠血清中分泌的 IL-10、VEGF顯著下降，有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。

表2 黃芪多糖對B16-F10荷瘤鼠血清IL-10、VEGF含量的影響

3 討論

黃芪性溫，味甘淡，有補氣固表、利尿排毒、排膿、托瘡生肌的功效［4］。黃芪多糖是黃芪中的主要活性成分，有提高機體免疫功能、抗病毒等作用［2］。近年來，黃芪多糖的抗腫瘤免疫機制得到了廣泛研究［4］。研究表明，黃芪多糖可通過多種方式起到抗腫瘤的作用［3］。首先，黃芪多糖可通過激活巨噬細胞，刺激其釋放 TNF-α、IFN-γ等細胞因子，發(fā)揮抗腫瘤作用［5］;其次，黃芪多糖可通過刺激 DC成熟，進而激活混合淋巴細胞反應和抗原特異性細胞毒性T(CTL)反應，發(fā)揮抗腫瘤作用［6］;再次，黃芪多糖可通過提高NK數量和活性、促進 Th細胞轉化、使T細胞亞群恢復平衡的機制，起到抗腫瘤作用［7］。本實驗結果顯示，黃芪多糖可有效提高B16-F10荷瘤鼠的抑瘤率，抑制腫瘤生長，進一步印證了黃芪多糖的抗腫瘤免疫活性。

腫瘤免疫耐受機制是造成腫瘤疫苗沒有較好療效的原因之一，目前已經得到了人們廣泛關注［8］。腫瘤組織中聚集著一群異質細胞，包括未成熟的樹突狀細胞、粒細胞、巨噬細胞等，其共同的表面標志為Gr-1+CD11b+，這群細胞被稱為髓樣抑制細胞(Myeloid de-rived suppressor cells，MDSC)，是引起腫瘤免疫逃逸的重要細胞群體［9］。IL-10是一種重要的免疫抑制因子，可通過對多種效應細胞和效應分子的抑制以及對腫瘤細胞的作用來抑制機體的抗腫瘤免疫，其作用包括抑制巨噬細胞功能、抑制 T淋巴細胞增殖和細胞因子合成等［10］。VEGF是由某些腫瘤細胞分泌而來，不但可誘導新生毛細血管生成，為實體腫瘤生長提供營養(yǎng)，而且可直接促進腫瘤生長，與實體腫瘤的生長和轉移有密切關系［11］。MDSC可分泌 TGF-β、IL-10等抑制性細胞因子，誘導產生CD4+CD25+Fox p3+調節(jié)性 T細胞，抑制機體免疫［12］，此外，MDSC與 VEGF的分泌有密切關系，MDSC可聚集在血管周圍，并促進VEGF分泌，進而促進實體腫瘤生長和轉移［13］。近年來，對黃芪多糖的抗腫瘤免疫機制主要集中在巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞、Th細胞等方面［3］，而對髓樣抑制細胞(MDSC)的影響報道甚少。本研究發(fā)現，黃芪多糖可抑制B16-F10荷瘤小鼠腫瘤生長，脾臟內Gr-1+CD11b+MDSC比例顯著下降，同時顯著抑制荷瘤鼠血清中 IL-10、VEGF釋放。提示:黃芪多糖可能通過抑制MDSC產生及其相關細胞因子的分泌，從而減緩腫瘤所產生的免疫逃逸現象，同時抑制VEGF的分泌，阻斷腫瘤營養(yǎng)供給，抑制腫瘤生長和轉移。

綜上，適當濃度的黃芪多糖可通過降低 MDSC的比例，抑制相關細胞因子 IL-10及VEGF的分泌來發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。

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