廖洪峰，王桂敏，李明慧，張 威，王志義，劉丹平

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生院，遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遼寧 錦州 121001;3.錦州石化醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)系由多種原因引起的一種骨?。?～3］，其特點(diǎn)是單位體積內(nèi)骨量減少，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁大小及數(shù)目均減少，從而引起腰背和四肢疼痛，骨脆性增加，最終可導(dǎo)致骨折。目前各種治療方法和治療藥物不斷出現(xiàn)，主要有激素替代療法(HRT)、降鈣素類(lèi)藥物(CT)、甲狀旁腺激素(PTH)、二磷酸鹽類(lèi)(BP)、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)、氟化物、鍶鹽等［4～6］，這些藥物或治療方法在一定程度上都能緩解OP的病情，但也伴隨著較大的副作用，如長(zhǎng)期服用雌激素可以出現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌，因而探索防治骨質(zhì)疏松癥的有效、安全的治療方法和藥物為我國(guó)的國(guó)家重點(diǎn)攻關(guān)課題之一。本文觀察首烏延壽丹對(duì)大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松的防治作用和可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和飼料

健康SD雌性大鼠 60只，體重 200g～220g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前置動(dòng)物于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，室溫20℃ ～28℃。采用清潔級(jí)架式分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用自來(lái)水。

1.2 藥物

首烏延壽丹由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中藥局提供，水煎制成，按照原方藥物用量(何首烏50g，豨薟草、菟絲子各15g，杜仲、牛膝、旱蓮草各10g等藥組成)。尼爾雌醇由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)0904100)。

1.3 儀器及試劑

QDR-4500A型雙能X線骨密度儀購(gòu)自美國(guó)HOLOGIC公司;550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;I型前膠原氨基末端前肽、I型膠原交聯(lián)羧基末端肽、骨鈣素、尿吡啶酚、尿肌酐試劑盒均產(chǎn)自sigma公司。

1.3.1 動(dòng)物分組 健康 SD大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫20℃ ～22℃，相對(duì)濕度為50% ～60%，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)，遵循隨機(jī)原則分成6組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、雌激素組、首烏延壽丹高、中、低劑量組。

1.3.2 動(dòng)物造模 將6組大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3ml/100g體重)，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠從腰背部脊柱兩側(cè)入路切除雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組大鼠重復(fù)摘除卵巢步驟，但不摘除卵巢，僅在卵巢與輸卵管連接處夾一下，術(shù)后給予青霉素肌肉注射，1萬(wàn)單位每只，連續(xù)5d抗感染。術(shù)后第2天開(kāi)始大鼠陰道涂片觀察，每天1次，連續(xù)5 d，以確定卵巢是否完全切除。除假手術(shù)組外，試驗(yàn)動(dòng)物從術(shù)后的第5天起全部進(jìn)入動(dòng)情間期，證明去勢(shì)徹底。而假手術(shù)組出現(xiàn)動(dòng)情期，證明未去勢(shì)。

1.3.3 給藥方法和劑量 術(shù)后第5天開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥12周。假手術(shù)組和模型組每天予以生理鹽水 1.79ml灌胃。雌激素組灌胃尼爾雌醇1.5mg/kg，每3d1次，其余2d時(shí)間灌等量生理鹽水。低劑量組灌胃1.79ml中藥(含3.04g生藥)，中藥中劑量組灌胃1.79ml中藥(含6.08g生藥)，中藥高劑量組灌胃1.79ml中藥(含9.12g生藥)，均每天給藥1次。

2 檢測(cè)指標(biāo)

2.1 骨密度測(cè)定

各組動(dòng)物于末次給藥后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，俯臥位置于QDR一4500A型雙能X線骨密度儀及“The Small Subject Scan”軟件測(cè)量分析股骨近端干髓端骨密度，掃描寬 15cm，掃描速度80mm/s，分辨率為310mm ×310mm。

2.2 血和尿生化指標(biāo)測(cè)定

6周時(shí)將大鼠放到代謝籠，禁食、禁水1d，避光進(jìn)行收集尿液，用消毒瓶裝好;處死前進(jìn)行頸動(dòng)脈穿刺取血，用離心機(jī)處理3000r/min，共10min，－20℃度冰箱保存。取上層血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清堿性磷酸酶(alkaline p h o s p h a t a se，ALP)、血鈣(Ca2+)、血磷(P3+)。取血清，用 ELESA方法測(cè)量骨鈣素(BGP)、I型前膠原氨基末端前肽(PINP)、I型膠原交聯(lián)羧基末端肽(ICTP);取尿液，用ELESA方法測(cè)量尿吡啶酚(PYD)、尿肌酐(UCr);均用美國(guó) Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀讀取數(shù)值，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用計(jì)算機(jī)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先確定樣本是否符合正態(tài)分布，再行方差齊性檢驗(yàn)，用單因素方差分析進(jìn)行多重性組間差異性比較，P＜0.05差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 動(dòng)物數(shù)量分析

最終進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析的大鼠保持為6組，共計(jì)60只，無(wú)缺失值。

4.2 統(tǒng)計(jì)推斷

4.2.1 各組大鼠骨密度測(cè)定 表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組骨密度值顯著性降低(P＜0.01)，說(shuō)明骨質(zhì)疏松大鼠模型制造成功。與模型組比較，中藥各組和雌激素組骨密度值顯著性升高(P ＜0.01)。

表1 各組大鼠BMD測(cè)量結(jié)果

4.2.2 各組大鼠 Ca2+、P3+、ALP 測(cè)量結(jié)果

表2 各組大鼠Ca2+，P3+，ALP測(cè)量結(jié)果

4.2.3 各組大鼠 PYD、U-Cr、PYD/U-Cr測(cè)量結(jié)果 表3顯示，與模型組比較，假手術(shù)組、雌激素組和中藥各組PYD、U-Cr、PYD/U-Cr均顯著性降低(P＜0.01)。與雌激素組比較，中藥各組PYD顯著性升高(P＜0.01)。

表3 各組大鼠 PYD、U-Cr、PYD/Cr測(cè)量結(jié)果

4.2.4 各組大鼠 BGP、PINP、ICTP 測(cè)量結(jié)果表4顯示，與模型組比較，假手術(shù)組、雌激素組和中藥各組BGP、PINP、ICTP均顯著性降低(P＜0.01)。與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組 PINP值降低(P ＜0.05)。

表4 各組大鼠 BGP，PINP，ICTP測(cè)量結(jié)果

5 討論

骨質(zhì)疏松的建模方法如去勢(shì)法、維甲酸誘導(dǎo)法、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)法等，其中去勢(shì)法建模是美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的研究骨質(zhì)疏松癥的最佳方法。本實(shí)驗(yàn)中各組動(dòng)物的血清鈣和血清磷水平差異均不顯著，這說(shuō)明體內(nèi)雌激素水平的改變似乎不會(huì)直接影響血中的鈣和磷含量。雌激素可與甲狀旁腺素相拮抗，從而降低破骨細(xì)胞的作用，減慢骨質(zhì)再吸收作用，骨質(zhì)疏松組動(dòng)物雌激素水平下降，溶骨過(guò)程加強(qiáng)，血中鈣和磷含量似應(yīng)上升。但是由雌激素水平下降所引起的破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，也能促使成骨細(xì)胞反應(yīng)性地加強(qiáng)其功能活性，分泌更多的促進(jìn)成骨作用的細(xì)胞因子，并加快骨組織的礦化速度，建立破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的新平衡，由此使血中鈣和磷含量不發(fā)生明顯變化。血清中堿性磷酸酶50%來(lái)源于骨組織，另外部分堿性磷酸酶來(lái)自于肝臟肝細(xì)胞分泌，由于堿性磷酸酶是同工酶，因此它對(duì)骨組織而言缺乏特異性和敏感性［7］。本實(shí)驗(yàn)中各組動(dòng)物血清鈣、血清磷、堿性磷酸酶在各組均無(wú)明顯改變，說(shuō)明單純應(yīng)用血清鈣、血清磷、堿性磷酸酶等經(jīng)典骨代謝生化指標(biāo)檢測(cè)骨轉(zhuǎn)化狀況，存在特異性低和敏感性低的缺點(diǎn)。

PYD是骨內(nèi)I型膠原的重要組成成分，當(dāng)骨溶解時(shí)，骨膠原分子蛋白水解，則PYD即以游離狀態(tài)進(jìn)入血液并以原形直接從腎臟排出，因此尿中的PYD含量能夠反映出骨吸收的程度。本實(shí)驗(yàn)雌激素組和中藥各組明顯減少PYD的排出量，較模型組PYD/U-Cr明顯減低，明顯減少I(mǎi)型膠原的分解，因而降低骨吸收。

BGP又稱(chēng) γ-羧基谷氨酸蛋白(Bone G l a Protein)，是成骨細(xì)胞合成和分泌的一種激素樣多肽，是反映骨更新?tīng)顟B(tài)和骨形成的一種特異性指標(biāo)。血清骨鈣素水平是反映成骨細(xì)胞活性、骨轉(zhuǎn)換和骨形成的特異指標(biāo)［8］。骨形成或骨轉(zhuǎn)換增加均可使血清BGP增加。補(bǔ)充首烏延壽丹和尼爾雌醇后BGP水平降低，說(shuō)明首烏延壽丹和尼爾雌醇能抑制去勢(shì)大鼠骨轉(zhuǎn)換，使去勢(shì)大鼠成骨細(xì)胞活性降低。

Ⅰ型膠原存在于骨、肌腱和皮膚中是骨組織中惟一的膠原，占骨基質(zhì)的90%。I型膠原衍生自一個(gè)較大的蛋白，即 I型前膠原，PINP即 I型前膠原氨基末端前肽，是I型前膠原細(xì)胞外分解產(chǎn)物，其血液中的含量主要反映I型膠原的合成速率和骨轉(zhuǎn)換的情況，升高提示I型膠原合成速率加快，骨轉(zhuǎn)換活躍。目前認(rèn)為，PINP是新骨形成的特異性敏感指標(biāo)［9］。ICTP是Ⅰ型膠原蛋白降解過(guò)程中的另一個(gè)特異性產(chǎn)物，只來(lái)源于破壞的成熟骨基質(zhì)，不再進(jìn)一步分解，按膠原降解比例1/1釋放入血。血清ICTP的變化與骨形態(tài)計(jì)量學(xué)骨吸收參數(shù)呈顯著正相關(guān)，并與骨吸收生化指標(biāo)尿砒啶酚和脫氧吡啶酚呈正相關(guān)［10］。因此，血清 ICTP水平是破骨細(xì)胞性膠原降解的靈敏指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)去勢(shì)后大鼠補(bǔ)充首烏延壽丹和雌激素后，較模型組 BGP、PINP、ICTP值均明顯減低，說(shuō)明首烏延壽丹和雌激素能抑制去勢(shì)大鼠骨轉(zhuǎn)換，使大鼠成骨細(xì)胞活性減低，破骨細(xì)胞功能受到抑制。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎“主骨生髓”，骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、修復(fù)都有賴(lài)于腎之精氣的滋養(yǎng)和推動(dòng)。隨著年齡增高，腎氣漸衰，筋骨懈惰，臨床可見(jiàn)腰背酸痛、骨痛、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，故其病因病機(jī)可歸納為腎虛、脾虛，其中以腎虛為主，屬中醫(yī)“骨痹”、“骨痿”范疇。本方中何首烏、菟絲子、杜仲、旱蓮草、黑芝麻、女貞子、金櫻子補(bǔ)腎益精，牛膝、薟草等活血通脈，諸藥合用共奏補(bǔ)腎活血之功，是延緩衰老之名方。

雌激素替代療法防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松已經(jīng)得到公認(rèn)，這種療法既降低骨吸收又抑制骨形成，使雌激素缺乏所誘導(dǎo)的過(guò)度骨轉(zhuǎn)換水平下降，以增加骨量［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，首烏延壽丹對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的防治作用與降低骨轉(zhuǎn)換有關(guān)，同時(shí)首烏延壽丹對(duì)骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)的抑制作用較雌激素小，推測(cè)應(yīng)用更長(zhǎng)時(shí)間，首烏延壽丹的防治效果可能優(yōu)于雌激素。首烏延壽丹防治骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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