焦 宏，陳彥靜、△，金春亭，鞠大宏，王 筠，王樹強(qiáng)

(1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

流行病學(xué)、實(shí)驗動物學(xué)和臨床研究均表明，高脂血癥是動脈粥樣硬化、心腦血管病的重要危險因素［1］。尋找有效的防治高脂血癥藥物已成為目前的迫切任務(wù)，中藥在調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動脈硬化及心腦血管疾病方面具有未病先防和既病防變的優(yōu)勢［2］。“損其心者，調(diào)其營衛(wèi)”是早在《難經(jīng)》就提出的心系疾病的治法，近年來人們對其治療心系病癥越來越重視。桂枝湯是《傷寒論》的代表方之一，盡管歷代醫(yī)家以桂枝湯類方治療心系病證取得了很大成就，現(xiàn)代實(shí)驗研究也證明桂枝湯具有抗菌、抗病毒、抗過敏、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血壓、降血糖、增加心肌血流量、改善胃腸消化傳導(dǎo)等廣泛的藥理作用［3-5］，但桂枝湯是否通過改善消化功能、調(diào)理脾主運(yùn)化功能進(jìn)而達(dá)到祛除痰濕(調(diào)節(jié)脂代謝)的作用環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)防治心系病證(冠心病)的功效，值得深入研究。為此，本研究采用高脂血癥大鼠心肌缺血(胸痹)模型，探討桂枝湯對冠心病(胸痹)模型大鼠血脂代謝的調(diào)節(jié)作用，為冠心病(胸痹)的防治提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料

1.1 材料、試劑

高脂飼料:由10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2% 丙基硫氧嘧啶、0.1% 鈣片和 87.2% 普通飼料配制成。桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗及所有藥材均購自北京同仁堂藥店。按原方比例10∶10∶7∶10∶10配齊藥物(生姜切片，大棗剖開)混合，水浴濃縮成10g/L、20g/L濃度。血脂測定試劑盒(TG、TC、HDL-C、LDL-C)購于北京中生生物工程高技術(shù)公司，總脂酶測試盒(脂蛋白脂酶 LPL和肝脂酶HL)購于南京建成生物工程研究所。

1.2 動物與分組

健康雄性 SD大鼠 60只，體重 250g～270g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗動物科學(xué)部提供。隨機(jī)分為5組，即對照組、模型組、辛伐他汀組、桂枝湯10g治療組(簡稱桂枝湯低劑量組)、桂枝湯20g治療組(簡稱桂枝湯高劑量組)，各組動物12只。

2 方法

2.1 動物模型建立

大鼠普通喂養(yǎng)1周后眶內(nèi)采血檢測血脂正常者用于實(shí)驗。高脂飼料喂養(yǎng)12周，每天15g，期間按70萬IU/kg的總劑量肌肉注射給予VD3，于第1周、第4周、第8周初分次給完，建立大鼠高血脂及 AS早期的模型。末次給藥前72h，除空白組外，于灌胃給藥30min后，各組動物腹腔注射垂體后葉素30u/kg，空白組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)3次，每間隔24h，誘發(fā)冠狀動脈痙攣，通過心電圖測定出現(xiàn)明顯的 ST段壓低，形成心肌缺血模型［6］。

2.2 給藥方法

于實(shí)驗第12周末大鼠禁食12h斷尾取血，檢查各組大鼠血清總膽固醇含量，高脂飼料喂養(yǎng)各組大鼠與空白對照組比較，均有明顯差異之后，各治療組分別開始灌胃給藥。桂枝湯治療組:于第13周起開始灌胃給藥，每日1次。桂枝湯大、小劑量組給藥劑量分別為 20g/kg·d、10g/kg·d(含生藥量)，l0ml/kg灌胃給藥，1次/d，連續(xù)6周。西藥對照組:辛伐他汀 5.0mg/kg·d，為成人劑量的 20 倍，10ml/kg灌胃給藥，1次/d，連續(xù)6周，正常組和模型組以相應(yīng)量的生理鹽水灌胃。

2.3 標(biāo)本的制備及檢測

實(shí)驗結(jié)束，從腹主動脈采血5ml，3500rpm，離心10min，制備血清、血漿。

2.3.1 血脂各項指標(biāo)的測定 按試劑盒說明測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度膽固醇(HDL)，根據(jù)公式 LDL-c=TC-(TG/5+HDL-C)計算低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-c)水平。

2.3.2 血清脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶(HL)活性測定 LPL和HL可分解甘油三酯并水解為甘油和游離脂肪酸，用銅試劑測定生成的游離脂肪酸的量，分別計算脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶(HL)活性。

2.3.3 血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量測定 取血清按照試劑盒要求測定吸光度值，計算相應(yīng)酶活性。

2.3.4 肝臟組織蘇丹紅Ⅳ染色觀察 大鼠取血后迅速取出肝臟，觀察肝臟的外觀并取肝臟右葉邊緣1cm處一小塊肝組織進(jìn)行冰凍切片蘇丹紅IV染色，在光鏡下觀察肝組織變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。采用單因素方差分析，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)有差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清中 TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度的變化

表1顯示，高脂喂養(yǎng)12周時，與對照組相比，模型組 TC、TG、LDL-C均顯著增高(P ＜0.01)，HDL-C濃度顯著降低(P＜0.01)。結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)大鼠形成高脂血癥動物模型。

表1 12周各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度的變化(mmol/L)

表2顯示，高脂喂養(yǎng)18周后，模型組與對照組相比血清 TC、TG、LDL-C濃度明顯升高(P＜0.01)，HDL-C濃度明顯降低(P＜0.01);陽性對照辛伐他汀組和模型組相比，血清TC、TG、LDL-C濃度明顯降低(P＜0.01)，HDL-C濃度升高(P＜0.05);與模型組比較，桂枝湯高、低劑量組均有顯著降脂作用(P＜0.01)，且桂枝湯高劑量組降脂作用強(qiáng)于他汀組。

表2 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度的變化(mmol/L)

3.2 各組大鼠血漿中LPL和HL的變化

表3顯示，與對照組相比，模型組血漿中 LPL和HL含量明顯降低(P＜0.01);陽性對照辛伐他汀組和桂枝湯高、低濃度組與模型組相比，血漿中LPL和HL含量明顯升高(P＜0.01或0.05);且桂枝湯高濃度組作用強(qiáng)于陽性對照組。

表3 各組大鼠血漿LPL、HL、SOD和MDA的變化(n=8)

3.3 各組大鼠血漿中超氧化物歧化酶(SOD) 活性及丙二醛(MDA)含量測定

表3顯示，與對照組相比，模型組血漿 SOD含量明顯降低(P＜0.01)，MDA明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，各治療組血漿SOD含量明顯升高(P＜0.01)，MDA明顯降低(P＜0.05)，且桂枝湯高濃度組作用強(qiáng)于陽性對照組。

3.4 各組大鼠肝臟的病理學(xué)變化

病理學(xué)檢查:肉眼觀察大鼠肝臟大體變化，正常組大鼠肝臟外觀呈紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)軟有彈性;模型組大鼠肝臟腫大易碎、包膜稍緊張，外觀呈黃紅和灰紅相間，表面和切面油膩，治療組外觀色澤接近于正常組。

圖1顯示，冰凍切片鏡下觀察可見肝細(xì)胞核藍(lán)染，脂滴呈橘紅色。正常對照組肝細(xì)胞形態(tài)排列正常，肝小葉規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，可見少量脂滴分布。模型組多數(shù)肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓基本消失，肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿內(nèi)充滿大量橘紅色脂滴，大脂滴和中等大小脂滴較多，呈重度脂肪肝病變。各藥物治療組整個肝小葉脂肪滴明顯減少，脂肪病變程度明顯改善。

圖1 肝臟組織病理組織學(xué)觀察結(jié)果(蘇丹紅Ⅳ染色×400)A.對照組 B.模型組C.辛伐他汀組D.桂枝湯高劑量組

4 討論

高脂血癥是指血液中一種或多種脂質(zhì)成分含量的異常增高。研究顯示，血脂異常代謝導(dǎo)致對動脈血管壁的損傷，是形成動脈粥樣硬化的重要促進(jìn)因素，也是高血壓、冠心病和腦血管意外的重要危險因素［7、8］。因此，保持正常的血脂水平是預(yù)防心腦血管疾病發(fā)生的重要措施之一。本實(shí)驗結(jié)果表明，與模型組比較，桂枝湯高、低劑量組血清 TG、TC、LDLC含量有不同程度的降低，尤其是桂枝湯藥高劑量組作用較顯著，同時可以升高HDL-C含量。桂枝湯治療組HDL的升高，意味著膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)作用的增強(qiáng)，影響HDL代謝的同時也起著降脂作用。

LPL 和 HL 是多種脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶［9、10］，LPL表達(dá)或活性增高可以降低血清中TG、LDL和極低密度脂蛋白(VLDL)的水平，從而防止高脂血癥的發(fā)生。LPL可催化乳靡微粒(CM)和VLDL中的甘油三酯水解，HL進(jìn)一步催化水解CM和VLDL殘骸顆粒中的甘油三酯［11］。本研究結(jié)果顯示，桂枝湯可增加血清LPL、HL的活性，提示桂枝湯可通過影響脂蛋白代謝酶途徑調(diào)節(jié)高脂大鼠血脂代謝。

肝臟是脂肪代謝的重要器官，高脂性飼養(yǎng)引起大鼠脂質(zhì)代謝紊亂時會出現(xiàn)血脂升高以及肝臟的脂質(zhì)堆積［12］。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，桂枝湯能夠減輕高脂大鼠肝臟脂肪變性，其原因可能和桂枝湯降低高脂大鼠血清TC、TG、LDL-C水平，減少 TC和TG在肝臟中蓄積有關(guān)。此外，脂肪肝的形成還與肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷引起的“二次打擊”有關(guān)。從實(shí)驗結(jié)果分析我們認(rèn)為，桂枝湯減輕高脂大鼠肝臟脂肪變性與降低肝臟血液中 MDA含量、提高SOD活性，與肝組織抗氧化損傷有關(guān)。

綜上，我們認(rèn)為桂枝湯具有明顯的調(diào)節(jié)脂代謝的作用，其機(jī)制可能通過健脾和胃、補(bǔ)益中氣、調(diào)節(jié)營衛(wèi)，恢復(fù)虛弱之脾氣，以盡其分清泌濁之職守，使滯留營中膏脂減少，同時和提高大鼠總抗氧化能力有關(guān)，對動脈粥樣硬化及冠心病的防治具有重要意義，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步的研究。

［1］ Selwyn AP.Antiatherosclerotic effects of statins:LDL versus non-LDL effects［J］.Curr A theroscler Rep，2007，9(4):281-285.

［2］ 黃 銳.中醫(yī)對高脂血癥的認(rèn)識和治療［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，8(7):107-108.

［3］ 秦彩玲，劉 婷，張 毅，等.桂枝湯對大鼠血壓雙向調(diào)節(jié)作用及其有效部位探討［J］.中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2001，7(8):20-23.

［4］ 戴 敏，劉青云，丁 煒，等.桂枝湯對家兔心肌血流量的影響［J］.中國中藥雜志，1995，20(7)431-433.

［5］ 劉 婷，張 毅，秦彩玲，等.桂枝湯降壓作用機(jī)制初探—對血漿及組織中 AT，NT 含量的影響［J］.2005，40(6)421-423.

［6］ 焦 宏，陳彥靜，鞠大宏，等.桂枝湯對高脂血癥心肌缺血大鼠心肌缺血損傷的保護(hù)作用［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(3):279-281.

［7］ 張勤婷，李 輝，杜迎雪.膽固醇與動脈粥樣硬化性血管病變的研究［J］.中國民康醫(yī)學(xué)，2006，18(8):640-641.

［8］ 趙水平.臨床血脂學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:225-231.

［9］ Deeb S S，Zambon A，CarrM C，et al.Hepatic lipase and dyslipidemia:interactions among genetic variants， obesity，gender，and diet［J］.J L ipid Res，2003，44(7):1279-1286.

［10］ 蔡曼波，尹衛(wèi)東.脂蛋白酯酶活化劑 NO-1886的研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報，2004，20(3):251-254.

［11］ Perret B，Mabile L，Martinez L，et al.Hepatic lipase:structure/function relationship，synthesis，and regulation ［J］.J Lipid Res，2002，43(8):1163-1169.

［12］ Zou Y，Li J，Lu C，et al.High-fat emulsion-induced rat model of nonalcoholic steatohepatitis［J］.Life Sci，2006，79(11):1100-1107.