張 玲，王 燕，柴雅琴，袁 若

(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶現(xiàn)代分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715)

0 引言

核酸適體是一種在核酸分子中利用體外篩選技術(shù)得到的能與靶細(xì)胞高特異性、高親和力結(jié)合的單鏈寡核苷酸片段，可以是DNA，也可以是RNA[1～2]，它不僅可以與酶、生長因子等較大的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，還可以與金屬離子、氨基酸等小分子物質(zhì)結(jié)合，甚至可以與完整的病毒顆粒、細(xì)菌和細(xì)胞等結(jié)合[3～5]。適體傳感器是以核酸適體與目標(biāo)分子為識別元件的一種生物傳感器，相對于其他的傳感器，它的檢測范圍更廣。電化學(xué)檢測在快速、靈敏、簡便、無毒、低成本和活體檢測應(yīng)用等方面具有無可比擬的優(yōu)勢[6～9]，將核酸適體識別元件與各種電化學(xué)轉(zhuǎn)換器相結(jié)合構(gòu)建的新一代電化學(xué)適體傳感器，集成了適體傳感器和電化學(xué)傳感器兩方面的優(yōu)勢。

2004年，Ikebukuro等首次報道了一個基于核酸適體的電化學(xué)傳感器[10]，實(shí)現(xiàn)了對凝血酶的靈敏檢測。凝血酶是凝血過程中一種重要的絲氨酸內(nèi)蛋白酶，可以加速和鞏固凝血過程，調(diào)控炎癥和傷口愈合速度，其含量與白血病，動脈血栓癥及肝臟疾病密切相關(guān)?；陔娀瘜W(xué)適體傳感器靈敏度高、分析速度快、操作便利、成本低廉、易于實(shí)時檢測等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地對凝血酶進(jìn)行檢測。

石墨烯是由單層碳原子組成的六方蜂巢狀二維結(jié)構(gòu)，具有一些特殊優(yōu)異的性能，如大的比表面積[11]，高機(jī)械強(qiáng)度，以及超強(qiáng)的電子傳導(dǎo)能力[12]，作為一種高導(dǎo)電性能的優(yōu)質(zhì)材料，在電化學(xué)檢測以及電化學(xué)生物傳感器的使用發(fā)展中正得到有效利用[13～14]。碳納米管具有獨(dú)特的一維結(jié)構(gòu)、大的比表面積、超強(qiáng)的機(jī)械性能、高的化學(xué)和熱穩(wěn)定性以及良好的導(dǎo)電能力，近年來在工程材料的納米增強(qiáng)相、半導(dǎo)體材料、催化劑載體等方面均被人們寄以厚望[15～16]。用殼聚糖同時分散石墨烯和碳納米管，得到的石墨烯-碳納米管復(fù)合物不僅保留了石墨烯和碳納米管的特有性質(zhì)，還能提高其導(dǎo)電率及獲得更大的比表面積。

該文采用生物兼容性好的殼聚糖分散石墨烯-碳納米管的復(fù)合物修飾玻碳電極，以獲得更高的導(dǎo)電性和更大的比表面積用于固定電活性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的電子媒介體NiHCF，隨后，在其表面沉積生物兼容性好、穩(wěn)定性高和催化性能強(qiáng)的NanoPd用于固定TBA，HRP封閉后用于檢測TB。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)?shù)滓褐屑尤胍欢康腍2O2時，HRP和NanoPd對H2O2催化的同時能放大NiHCF的氧化峰，基于以上雙重催化作用，能大大提高傳感器的靈敏度。同時，該傳感器也具有穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好和檢出限低的優(yōu)點(diǎn)，是一種極有應(yīng)用前景的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI600B型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），F(xiàn)A2004A電子天平（上海精天電子儀器有限公司），DS-1510DT超聲清洗儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

石墨烯（中國南京先豐納米材料公司）；碳納米管（中國南京先豐納米材料公司）；殼聚糖（美國 Sigma 公司）；NiCl2·6H2O、KCl、K3Fe(CN)6（中國四川化學(xué)制品公司）；四氯鈀酸鉀（美國Sigma公司）；凝血酶適體（中國大連TaKaRa公司）；凝血酶（中國大連TaKaRa公司）；辣根過氧化物酶（美國Sigma公司）；過氧化氫（濃度30%，中國重慶化學(xué)制品公司）；Tris-HCl溶液 （瑞士Roche公司）；0.1 mol/L 磷酸緩沖溶液（pH=7.4，由 0.1 mol KH2PO4、0.1 mol Na2HPO4和 0.1 mol KCl配制）。所用其它試劑均為分析純或優(yōu)級純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 石墨烯-碳納米管復(fù)合物的制備

取15 mg殼聚糖加入到5 mL 1.0%的醋酸溶液中，在室溫下攪拌直至殼聚糖溶解，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為約0.3%的殼聚糖溶液，并使用濃NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH使其接近5.0。再取2 mL此溶液，加入1 mg純化的多壁碳納米管和1 mg石墨烯，超聲震蕩，混合均勻，得到1 mg/mL的CS-Gra-CNTs溶液。

1.3 鐵氰化鎳的制備

將70 mL 0.01 mol/L NiCl2溶液逐滴加入到劇烈攪拌的含有 0.05 mol/L KCl的 70 mL 0.05 mol/L K3Fe(CN)6溶液中，加完繼續(xù)劇烈攪拌5 min。再將混合液立即高速離心并洗滌數(shù)次后轉(zhuǎn)到真空干燥箱中，室溫下過夜，最終得到黃色粉末NiHCF。取20 mg該粉末溶解到2 mL PBS溶液中配制成溶液密封備用。

1.4 適體傳感器的制備

將玻碳電極 （φ=4 mm）依次用 0.3 μm，0.05 μm的Al2O3粉末拋光，然后依次用二次蒸餾水、無水乙醇、二次蒸餾水超聲清洗5 min，清洗后的電極置于室溫下晾干，隨后將電極置于0.1 mol/L的 PBS(pH=7.4)溶液中。 在 0 V～0.8 V 的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描極化處理至循環(huán)伏安圖穩(wěn)定為止。

在處理好的電極表面滴涂 6 μL CS-Gra-CNTs，于室溫下晾干成膜，繼續(xù)滴涂 4 μL NiHCF，于室溫下晾干成膜。然后，將電極置于K2PdCl4溶液中通過電化學(xué)沉積作用在電極表面修飾一層NanoPd。用PBS緩沖溶液清洗后，在該電極上滴加20 μL 5 μmol/L TBA，置于冰箱中4℃過夜（16～20 h）。取出用PBS緩沖溶液清洗晾干后，取20 μL 1 mg/mL HRP滴于電極上室溫封閉40 min（封閉未結(jié)合凝血酶適體的納米鈀活性位點(diǎn)）。該電極不用時放置在冰箱（4℃）中以保持酶的活性備用。圖1為電極制備過程示意圖。

圖1 適體傳感器的逐步組裝示意圖：(a)CS-Gra-CNTs單層膜的形成；(b)NiHCF膜的吸附；(c)NanoPd的形成；(d)TBA的固載；(e)HRP封閉非特異性活性位點(diǎn)；(f)檢測TBFig.1 The schematic illustration of the stepwise aptamer-based biosensors fabrication process:(a)formation of CS-Gra-CNTs monolayer;(b)adsorption of NiHCF;(c)formation of NanoPd monolayer;(d)TBA loading;(e)blocking with HRP(f)delection TB

1.5 測試方法

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：制備好的適體傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。選取含有2.5 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液為測試底液，在 0 V～0.8 V范圍內(nèi)，以100 mV/s速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。整個實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 適體傳感器的電化學(xué)表征

在 0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液中，0 V～0.8 V的電位范圍內(nèi)，以100 mV/s速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，研究電極制備過程的循環(huán)伏安特性，其結(jié)果示于圖2。曲線a是當(dāng)玻碳電極上修飾了一層CS-Gra-CNTs后的CV曲線，由于沒有電活性物質(zhì)的存在，因而無氧化還原峰電流；當(dāng)NiHCF化學(xué)吸附到CS-Gra-CNTs修飾的電極表面后，在0.4 V左右出現(xiàn)一對可逆性好的氧化還原峰 （曲線b）；將 NanoPd固定到NiHCF-CS-Gra-CNTs膜修飾的電極表面后，由于NanoPd易于傳輸電子，其氧化還原峰電流顯著增大（曲線c），表明NanoPd成功地固定到了電極表面；當(dāng)TBA吸附到納米鈀的表面時，氧化還原峰電流降低（曲線d），這是由于TBA是非導(dǎo)電性物質(zhì)，阻礙了電子的傳輸，使得電流值有所下降。最后，將HRP固定到修飾電極表面，封閉電極上可能存在的非特異性吸附位點(diǎn)，從圖2曲線e可看出，由于大分子蛋白質(zhì)對電極表面電子傳輸?shù)倪M(jìn)一步阻礙，氧化還原峰電流進(jìn)一步降低；與曲線e相比，曲線f表示修飾電極與10 nmol/L TB抗原孵育45 min后的CV曲線，氧化還原峰電流又進(jìn)一步降低，這是因?yàn)門B抗原與TBA發(fā)生特異性結(jié)合將膜表面的微孔通道堵塞，進(jìn)一步阻礙了電子的傳遞，從而進(jìn)一步降低了響應(yīng)電流。

圖2 電極在0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液中的循環(huán)伏安表征曲線。(a)CS-Gra-CNTs修飾的玻碳電極；(b)NiHCF/CS-Gra-CNTs修飾的電極；(c)NanoPd/NiHCF/CS-Gra-CNTs修飾的電極；(d)固定了TBA的電極；(e)經(jīng)HRP封閉并被H2O2催化的電極；(f)在TB中孵育的電極。掃速為100 mV/sFig.2 CVs of the different electrodes in 0.1 mol/L PBS solution(pH=7.4);(a)CS-Gra-CNTs modified electrode;(b)NiHCF/CS-Gra-CNTs modifiedelectrode;(c)NanoPd/NiHCF/CS-Gra-CNTs modified electrode;(d)TBA/NanoPd/NiHCF/CS-Gra-CNTs modified electrode;(e)CS-Gra-CNTs/NiHCF/NanoPd modified electrode blocked with HRP;(f)after incubation with TB.The scan rate was 100 mV/s

2.2 適體傳感器的電化學(xué)性質(zhì)

圖3 是修飾電極放入 0.1 mol/L PBS(pH=7.4)緩沖溶液中于0 V～0.8 V的電位范圍內(nèi)不同掃描速率下的循環(huán)伏安曲線。從圖中可以看出，隨著掃描速度的不斷增加，峰電流值也逐漸增加，且氧化還原峰的峰電流值掃描速率的平方根成正比，表現(xiàn)出明顯的擴(kuò)散電流特性（圖3插圖）。

2.3 適體傳感器信號放大對比

圖3 電極在不同掃速下于0.1mol/L PBS(pH=7.4)溶液中的的循環(huán)伏安曲線（從內(nèi)至外）：10、30、50、80、100、150、200、250、300、350 mV/sFig.3 CVs of the modified electrode at different scan rates(from inner to outer):10、 30、 50、 80、 100、 150、 200、 250、 300、 350 mV/s in 0.1 mol/L PBS solution(pH=7.4)

圖4 適體傳感器在不含H2O2(曲線a)與含H2O2(曲線b)的PBS中的CV曲線Fig.4 The CVs of aptasensor in PBS without(Curve a)and with H2O2(Curve b)

圖4是修飾電極用HRP封閉了非特異性吸附位點(diǎn)后，在底液中有無H2O2的循環(huán)伏安曲線。其中曲線a是酶修飾電極在0.1 mol/L PBS(pH=7.4)緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線，此時溶液中不含H2O2，只呈現(xiàn)NiHCF的一對氧化還原峰。當(dāng)向底液中加入H2O2溶液后，NiHCF的一對氧化峰和還原峰電流明顯增大（曲線b），這是因?yàn)殡姌O上的HRP以及NanoPd共同催化測試底液中的H2O2分解，此過程能有效放大NiHCF的氧化峰電流?；诖耍谕葪l件下，運(yùn)用放大的信號對目標(biāo)物的識別的靈敏度更高，因而能大大提高傳感器的靈敏度。

2.4 適體傳感器對不同濃度的凝血酶的電流響應(yīng)特性

用 pH=7.4 的分析純試劑（Tris-HCl溶液）配制不同濃度的TB溶液，將傳感器在濃度依次為0.01，0.1，1.5，10，20，30 nmol/L 的 TB 中 孵 育 45 min，并在含有 2.5 mmol/L的H2O2的PBS中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(圖5)，結(jié)果表明：隨著TB的濃度逐漸增大，峰電流值逐漸減小，并在1.0×10-5～3.0×10-2mol/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為 I=0.679 4c-123.8，相關(guān)系數(shù)達(dá) r=0.996 9，檢出下限為 3.0×10-6mol/L。

圖5 適體傳感器對不同濃度的TB的定量檢測Fig.5 Quantitative analysis of the aptamsensor for TB

2.5 適體傳感器的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

在含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液中連續(xù)掃描100圈，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化還原電流僅出現(xiàn)微小變化，第1圈與第100圈峰電流相比，電流僅下降4.9%（圖6），表明該適體傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

圖6 電極連續(xù)掃描100圈的循環(huán)伏安曲線Fig.6 The CVs of the aptasensor after scaning 100 cycles

取同批間制備的5支適體傳感器，分別對同一濃度的TB溶液進(jìn)行檢測，結(jié)果RSD＜3.4%(n=5)，表明該免疫傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

2.6 適體傳感器的選擇性

在修飾電極用HRP封閉了非特異性吸附位點(diǎn)后，分別用等量的TB、血清中免疫球蛋白(IgG)、牛血清白蛋白(BSA)和 HRP 孵育 45 min，然后在 0.1 mol/L PBS(pH=7.4)緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄孵育后與空白樣的電流的差值（圖7）。 結(jié)果表明：經(jīng)IgG、BSA、HRP孵育后的電極峰電流的差值很小，而與目標(biāo)物TB作用后，峰電流差值顯著增大，說明該適體傳感器對TB的檢測具有高度的選擇性。

3 結(jié)論

圖7 傳感器的選擇性Fig.7 The selectivity of the aptasensor

該文采用生物兼容性好的殼聚糖分散石墨烯-碳納米管的復(fù)合物修飾玻碳電極，以獲得更高的導(dǎo)電性和更大的比表面積用于固定電活性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的電子媒介體NiHCF，隨后，在其表面沉積生物兼容性好、穩(wěn)定性高和催化性能強(qiáng)的NanoPd用于固定TBA，HRP封閉后用于檢測TB，成功地制備了基于HRP與NanoPd對H2O2的雙重放大作用的一種檢測凝血酶的新型電化學(xué)適體傳感器。該電化學(xué)適體傳感器具有制備簡單、操作簡便、穩(wěn)定性好、壽命長、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好和檢出限低等特點(diǎn)，是一種極有應(yīng)用前景的測定方法。

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