鄧 可 肖志杰 黎肖弟

C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）是重要的急性期蛋白，作為經(jīng)典的炎癥介質(zhì)具有多種生理功能。炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化以及缺血事件的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。數(shù)個(gè)前瞻性研究顯示，單獨(dú)測(cè)量血清CRP水平可作為首發(fā)和再發(fā)腦血管事件的危險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子［1～3］。國外的大量研究證實(shí)CRP與種族相關(guān)，目前國內(nèi)尚無相關(guān)試驗(yàn)報(bào)道，本研究對(duì)此進(jìn)行了研究，采用病例－對(duì)照研究，探討rs1205基因多態(tài)性和缺血性腦卒中的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 腦梗死組來源于2007年7月～2007年12月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科急診室留觀或住院的中老年腦梗死患者105例，其中男75例，女30例；年齡37～92歲，平均年齡（64.1±11.4）歲；病程＜3 d；均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT／MRI證實(shí)。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分，其中病情為輕度（NIHSS＜6）59例，中度（NIHSS6～13）36例，重度（NIHSS＞14）10例。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）24.12±6.40。伴有冠心病史30例，高血壓病史92例，糖尿病史25例；腦卒中家族史21例，吸煙史46例，飲酒史18例。對(duì)照組為121名同期門診體檢者，其中男73例，女48例；年齡45～80歲，平均年齡（62.5±9.2）歲；BMI 23.74±3.05。伴有冠心病史15例，高血壓病史28例，糖尿病史2例；腦卒中家族史2例，吸煙史16例，飲酒史8例。入組者排除伴隨腦出血、合并周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病、大動(dòng)脈炎、血液病、結(jié)核或明顯肺部感染、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全者、曾接受器官移植者。腦梗死組和對(duì)照組在性別、年齡、BMI的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。常見的危險(xiǎn)因素如冠心病史、高血壓病史、糖尿病史、腦卒中家族史、吸煙史及飲酒史腦梗死組明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05）。

1.2 血清h-s CRP水平測(cè)定 所有入選對(duì)象（腦梗死患者在發(fā)病24 h內(nèi)，部分患者在發(fā)病的3 d內(nèi)）采集清晨空腹靜脈血2 ml，由本院檢驗(yàn)科用Hitachi 7170A全自動(dòng)生化分析儀，采用免疫透射比濁法測(cè)定超敏 C－反應(yīng)蛋白（high-sensitive C reactive protein，h-s CRP）水平。

1.3 CRP基因型測(cè)定 取肘靜脈血5 ml，采用低滲溶血、酚／氯仿法抽提外周白細(xì)胞基因組DNA，TE溶解保存；多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和限制性片段長度多態(tài)性測(cè)定rs1205基因多態(tài)性，引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

25μl PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5μl，Mg2＋25 mM1μl，4×dNTP25 nM1μl，上游和下游引物分別為10μM1μl，基因組DNA1μl，Taq酶5μ／μl 0.5μl，二甲基亞砜（DMSO）2.5μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系20μl：PCR產(chǎn)物10μl，10×Buffer R2μl，內(nèi)切酶2 U 酶切，37℃消化14 h。以pUC19DNA／MspI酶解片斷作為DNA片斷的標(biāo)準(zhǔn)物，20%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染（圖1）。

圖1 rs1205產(chǎn)物酶解片段20%聚丙烯酰胺凝膠電泳譜

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件包。多數(shù)計(jì)量資料近似正態(tài)分布，而CRP呈偏態(tài)分布，將其對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換為Log CRP，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)近似正態(tài)分布（Z＝0.988，P＝0.283）再行檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；分類資料采用卡方檢驗(yàn)；采用Logistic回歸模型判斷腦梗死危險(xiǎn)因素作用的大小，分別計(jì)算各自的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組與對(duì)照組基因型比較 在研究總?cè)巳海X梗死組＋對(duì)照組）中rs1205基因型的頻率分別為CC17.7%，CT48.2%，TT34.1%；等位基因C／T的頻率分別為0.418和0.582，符合 Hardy－Weinberg平衡（χ2＝0.018，P＝0.894）。腦梗死組和對(duì)照組的基因型及等位基因的分布趨勢(shì)相同，差異無顯著性（P＞0.05）（表2）。

表2 腦梗死組與對(duì)照組rs1205基因型的比較

2.2 CRP基因型對(duì)CRP水平的影響 rs1205的CC、CT、TT基因型的Log CRP水平分別為（0.357±0.669）、（0.252±0.597）、（0.165±0.636）Log mg／L，基因型的血清Log CRP水平呈逐一下降趨勢(shì)，但差異無顯著性（P＞0.05）（表3）。

2.3 CRP水平對(duì)腦梗死嚴(yán)重程度的影響 在對(duì)腦梗死患者入院后立即用美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分（National Institues of Health Stroke Scale，NIHSS）將其分為3類：輕（NIHSS＜6）、中（6≤NIHSS≤13）及重（NIHSS≥14）。其中評(píng)分為重的h-s CRP和Log CRP水平均高于其他兩組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

表3 CRP基因型對(duì)CRP的影響（±s）

表3 CRP基因型對(duì)CRP的影響（±s）

基因型 Log CRP（Log mg／L） P值rs1205 CC 0.357±0.669 0.309 CT 0.252±0.597 TT 0.165±0.636

表4 CRP水平對(duì)腦梗死嚴(yán)重程度的影響（±s）

表4 CRP水平對(duì)腦梗死嚴(yán)重程度的影響（±s）

注：與NIHSS輕、中組比較，＊P＜0.05

CRP水平 h-s CRP（mg／L）（中位數(shù)）Log CRP（Log mg／L）（images/BZ222.png±s）50中組（6≤NIHSS≤13）（n＝36） 4.06 0.52±0.67重組（NIHSS≥14）（n＝10） 28.99＊ 0.90±0.80輕組（NIHSS＜6）（n＝59） 2.91 0.43±0.＊

2.4 CRP基因型對(duì)腦梗死嚴(yán)重程度的影響 將腦梗死rs1205基因型與NIHSS評(píng)分制表如下，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，rs1205基因型與腦梗死嚴(yán)重程度均無關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異（P＞0.05）（表5）。

將三種基因型進(jìn)行DNA序列測(cè)定。由測(cè)序圖譜可以看出，CRP1846C＞T的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列CC型中的堿基C（圖2－1中箭頭所指）突變?yōu)門T型中的T（圖2-3中箭頭所指），這與酶切結(jié)果一致（圖2）。

表5 CRP基因型×NIHSS交叉表

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化作為腦梗死的基因病因，越來越多的證據(jù)表明它是一個(gè)慢性炎性的過程。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，年齡、性別、體重等多個(gè)臨床相關(guān)指標(biāo)影響血清CRP 水平［4，5］。rs1205單核苷酸多態(tài)性是 CRP常見多態(tài)性之一，位于3′-UTR區(qū)域。rs1205對(duì)h-s CRP水平影響的研究結(jié)果大相徑庭［6，7］。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs1205T等位基因的人群血清h-s CRP水平下降，但與CRP水平無顯著關(guān)聯(lián)。這可能與CRP的變化由多個(gè)因素影響，且遺傳影響較低［8］有關(guān)。

圖2 CRP1846C＞T PCR產(chǎn)物測(cè)序圖譜

rs1205在不同種族和地區(qū)的分布不同。通過對(duì)PUBMED SNP數(shù)據(jù)庫檢索獲得，rs1205T等位基因在歐洲人的分布頻率為0.333；在非洲人群中為0.150；在中國北京地區(qū)為0.556。在本研究中中國湖南漢族健康人群中rs1205單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有CC、CT、TT三種基因型；T等位基因頻率分別為0.579。等位基因T的分布頻率明顯高于歐洲人群而與中國北京人群分布相似。由此可見T等位基因在不同種族的分布可存在差異。

許多研究都證實(shí)，CRP水平與缺血性腦卒中的發(fā)病相關(guān)［9，10］。而關(guān)于CRP基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系卻存在爭議。Morita A等檢測(cè)了4個(gè)人類 CRP基因SNP基因型：rs1341665，rs1800947，rs1130864，rs1205后發(fā)現(xiàn)僅rs1800947與缺血性腦卒中有顯著關(guān)聯(lián)［11］。Kuhlenbaeumer G［12］等對(duì)4個(gè)SNPs（rs3093075，rs1205，rs1130864，rs1800947）研究發(fā)現(xiàn)，沒有相關(guān)的SNP位點(diǎn)或SNP單體型與整體的缺血性腦卒中相關(guān)，但三個(gè)單核苷酸多態(tài)性（rs3093075，rs1130864和rs1800947）與微血管閉室呈顯著的關(guān)聯(lián)。Wang Q等的研究沒有發(fā)現(xiàn)rs1205與缺血性腦卒中相關(guān)，但單體型H3與缺血性腦卒中相關(guān)。本研究沒有對(duì)腦卒中類型進(jìn)行細(xì)分及構(gòu)建單體型，研究發(fā)現(xiàn)重型腦梗死患者的hsCRP水平顯著高于輕、中度組，rs1205基因型與腦梗死及腦梗死病情的嚴(yán)重程度均無關(guān)，與之前的結(jié)果一致。

本研究采用病例－對(duì)照配比研究，標(biāo)本量偏??；本研究沒有對(duì)腦卒中進(jìn)行細(xì)分研究，研究結(jié)果與他人有差異，但可能與樣本選擇、種族差異等有關(guān)，有必要擴(kuò)大樣本量、多地區(qū)間進(jìn)行比較，以進(jìn)一步探討。

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