姚志文 王紅忠 蔡 琛 楊 安 劉 唯 李紅玖 程由勇 李春華 陳治清

1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院口腔科，廣東深圳 518104；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔材料教研室，四川成都 610041

組織工程支架材料應(yīng)用時，單一的材料往往難以同時滿足生物體對其力學(xué)強(qiáng)度、親水性、易成型性和生物相容性等多方面的要求，為了盡量同時滿足這些要求，人們往往通過幾種生物材料的組合來達(dá)到預(yù)期目的。基于這個思路，本課題選用細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）、聚乳酸乙醇酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）和羥基磷灰石（HA）通過溶劑澆鑄/粒子浸出法制備多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架，分析其相關(guān)理化性能，通過體外MG-63細(xì)胞培養(yǎng)，初步評價其體外生物相容性及在組織工程中的應(yīng)用可行性。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，上海），CO2培養(yǎng)箱（Sanyo，日本），LDZ5-2臺式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），YJ-1450型超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司，江蘇），倒置相差顯微照相系統(tǒng)（Olympus，日本），JSM-6360LV電子顯微鏡（EJOL，日本），HTS7000 plus多孔板紫外/熒光/可見光高效分析儀（PE，美國）。

1.2 主要試劑

高糖 DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國），胎牛血清（Gibco，美國），胰蛋白酶（Gibco，美國），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma，美國），二甲基亞砜（Sigma，美國），乙二胺四乙酸（Sigma，美國），Braford蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），成骨樣細(xì)胞MG-63（四川大學(xué)口腔疾病國家重點實驗室）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架的制備

取1.0 g的PLGA和5 mL氯仿配成溶液，加入經(jīng)過目篩的粒徑為 100～200 μm 的 NaCl晶體 1.0 g和 HA 0.3 g，磁力攪拌和超聲振動使其均勻分散。室溫下將以上配好的PLGA溶液倒入底層鋪有BC膜的玻璃皿中。靜置24 h，干燥后PBS液反復(fù)漂洗，冷凍干燥后裁剪成直徑5 mm圓片。25 kGy60Co照射24 h消毒滅菌。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架相關(guān)理化性能分析

2.1.2.1 表面形貌觀察 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架表面噴金后放置樣品臺進(jìn)行掃描電鏡觀察。

2.1.2.2 抗張強(qiáng)度（δb）多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架裁剪成一定的形狀，用千分尺測其厚度和寬度。使用萬能電子拉力實驗機(jī)進(jìn)行測試，根據(jù)公式 δb＝F/A（F：支架的最大拉力，A：支架的截面面積）計算出支架的抗張強(qiáng)度（δb）

2.1.2.3 孔隙結(jié)構(gòu)測定 用乙醇裝滿一個小瓶記錄重量為W1，支架稱重記錄為Ws，然后浸泡于該瓶乙醇中，支架的孔中都充滿乙醇后，瓶子再加滿乙醇，稱重記錄W2，然后把浸滿乙醇的支架取出，剩余乙醇和小瓶稱重記錄為W3，ρ=0.79 kg/m3為乙醇的密度。根據(jù)以下公式計算孔隙率：

復(fù)合支架本身體積：Vs=（Wl+Ws-W2）/ρ

復(fù)合支架孔體積：Vp=（W2-W3-Ws）/ρ

復(fù)合支架孔隙率：ε=Vp/（Vs+Vp）=（W2-W3-Ws）/（W1-W3）

2.1.3 多孔BC-PLGA復(fù)合支架體外生物相容性分析

2.1.3.1 MG-3細(xì)胞在支架表面的形態(tài)學(xué)觀察 MG-63細(xì)胞從凍存管復(fù)蘇后培養(yǎng)換液，2.5 g/L胰酶常規(guī)傳代，倒置相差顯微鏡下觀察生長狀態(tài)，選取生長良好的第3代細(xì)胞在24孔板內(nèi)以2×105/mL的細(xì)胞濃度接種至多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架表面，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)5 d后取出標(biāo)本，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，樣本表面噴金后電鏡掃描觀察。

2.1.3.2 MTT比色法檢測細(xì)胞在支架材料表面的增殖 MG-3細(xì)胞在24孔板內(nèi)以2×105/mL的細(xì)胞濃度接種至多孔BCPLGA-HA復(fù)合支架表面，培養(yǎng)1、3、5 d后各孔內(nèi)分別加入MTT液100 μL，37℃孵育4 h。吸出孔內(nèi)液體后每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩 10 min，吸取上清液用酶聯(lián)免疫分光光度計 （490 nm）測定各孔光吸收值。同時以MG-3細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)板底部作為對照組。

2.1.3.3 ALP活性檢測 MG-3細(xì)胞在24孔板內(nèi)以2×105/mL的細(xì)胞濃度接種至多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架表面，培養(yǎng)5 d后取相應(yīng)樣本，提取和制備支架材料上生長的全部細(xì)胞凍融液，參照ALP試劑盒和Braford試劑盒步驟測定細(xì)胞勻漿的中蛋白含量和ALP活性。同時以MG-3細(xì)胞直接接種于培養(yǎng)板底部作為對照組。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.2 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，對MTT實驗所得數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析法，對ALP檢測所得數(shù)據(jù)采t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 結(jié)果

2.3.1 多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架相關(guān)理化性能分析

2.3.1.1 表面形貌觀察 支架內(nèi)部可見各種裂隙樣或孔洞樣的結(jié)構(gòu)將材料分割為多孔的海綿狀，孔大小為20～200 μm不等，部分孔表面可見覆蓋膜樣結(jié)構(gòu)。10 000倍電鏡下可見粒徑約為幾百納米到幾個微米形狀不規(guī)則的HA分布在不平整的PLGA膜上。制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架掃描電鏡觀察見圖1、2。

2.3.1.2 抗拉強(qiáng)度結(jié)果 本實驗制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架的抗張強(qiáng)度測試結(jié)果為（8.923 1±0.901 2）N/mm2，理論上能夠滿足一定的組織工程支架力學(xué)的要求。

2.3.1.3 孔隙率測定 在測定支架的孔隙率時發(fā)現(xiàn)，所制備的多孔支架沒有發(fā)生明顯的溶脹現(xiàn)象，保持了原來的大小和形貌。本實驗制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架的孔隙率測定結(jié)果為（64.73±5.65）%，提示所得支架具有較好的內(nèi)部貫通結(jié)構(gòu)。

2.3.2 多孔BC-PLGA復(fù)合支架體外生物相容性分析

2.3.2.1 MG-3在支架表面的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)5 d后有一定數(shù)量的細(xì)胞黏附在復(fù)合支架表面并開始增殖（圖3），細(xì)胞與支架表面貼壁緊密，細(xì)胞間以偽足連接，已達(dá)到一定程度的匯合，胞體豐滿，折光較為明顯，部分細(xì)胞已經(jīng)深入到材料表面裂隙中生長。

2.3.2.2 MG-3在支架材料上的增殖活性檢測 重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，不同實驗組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；不同時間組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；其中，第1天多孔BC-PLGA-HA組和空白對照組間光密度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.217），第 3、5天多孔 BC-PLGA-HA 組的光密度值均高于對照組（P＜0.005），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示MG-3細(xì)胞在多孔BC-PLGA-HA支架材料表面具有更強(qiáng)的增殖活性。MTT法測定多孔BC-PLGA-HA組和對照組細(xì)胞的成活和增殖能力結(jié)果見圖4。

2.3.2.3 MG-3在支架材料上的ALP活性檢測 MG-63細(xì)胞在多孔BC-PLGA-HA組和對照組培養(yǎng)基中生長5 d后，測定ALP表達(dá)，結(jié)果顯示，多孔BC-PLGA-HA組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.207，P<0.05），表明多孔 BC-PLGA-HA復(fù)合支架材料更有利于成骨細(xì)胞生長分化和成骨活性的表達(dá)。見表1。

表1 成骨樣細(xì)胞MG-63的蛋白濃度和堿性磷酸酶活性（±s，n=4）

表1 成骨樣細(xì)胞MG-63的蛋白濃度和堿性磷酸酶活性（±s，n=4）

組別 測定管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度樣品蛋白濃度（gport/L）ALP活性（金氏單位）多孔BC-PLGA-HA組對照組0.097±0.007 0.017±0.002 0.251±0.005 0.251±0.005 1.48±0.17 1.41±0.03 26.21±0.11 4.33±0.08

3 討論

生物支架是組織工程重要要素之一，對種子細(xì)胞起到支撐和模板作用，是其附著的基本框架和代謝場所，支架的孔結(jié)構(gòu)形狀、尺寸大小和孔隙率對細(xì)胞的黏附、增殖和分化有著很重要的影響，但具體多大孔徑為最佳目前尚未有統(tǒng)一的說法，F(xiàn)reyman等[1]認(rèn)為孔徑為 100～200 μm 較適合細(xì)胞生長。此外支架的高孔隙率（>90%）和相互貫穿的孔形態(tài)有利于細(xì)胞的種植生長、營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸以及血管和神經(jīng)的內(nèi)生長，但孔徑和孔隙度的[2]增加同時會降低支架的生物力學(xué)強(qiáng)度。

支架材料種類的選擇和制備方法對支架性能的影響有著重要的影響。本課題將BC、PLGA和HA三種材料通過溶液澆鑄/粒子瀝濾法制備多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架，基于如下考慮：（1）溶液澆鑄/粒子瀝濾法是較為成熟的制備可控孔徑多孔生物支架的方法[3]；（2）HA中有接近正常骨組織鈣/磷比，同時具有良好的骨傳導(dǎo)性[4]；（3）PLGA降解后在局部積聚的酸性代謝物容易引起無菌性炎癥發(fā)生。HA表面溶解后呈弱堿性，能夠緩沖或中和PLGA降解產(chǎn)生的酸[5]；（4）BC有著良好的理化性能[6-7]：①具有厚度為3～8 nm的納米級超細(xì)纖維，大小僅為人工合成纖維的1/10；②具有高抗張強(qiáng)度和彈性模量，揚(yáng)氏模量可達(dá)1.5×1010Pa，抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要強(qiáng)5倍；③具有良好的持水性和透氣性能，內(nèi)部有很多“孔道”使其能吸收60～700倍于其干重的水份。預(yù)期BC的加入可以補(bǔ)償材料因降解過程中產(chǎn)生的物理機(jī)械性能下降，從而使復(fù)合支架在修復(fù)功能區(qū)和負(fù)荷區(qū)時可以較長時間地保持良好的力學(xué)性能。本課題選用粒徑為100～200 μm的造孔劑，掃描電鏡觀察制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架呈多孔狀結(jié)構(gòu)，孔形狀略不規(guī)則，大小20～200 μm不等，孔的形狀可能和造孔劑形狀相關(guān)，出現(xiàn)部分較小孔徑原因可能是在篩選造孔劑時混雜有小部分更小尺寸造孔劑所造成。高倍率下可見粒徑不等的HA散在支架孔的底部。

抗拉強(qiáng)度和孔隙率是衡量生物材料理化性能的兩個重要指標(biāo)。材料斷裂前所達(dá)到的最大應(yīng)力值稱為抗拉強(qiáng)度，它可以代表材料的部分力學(xué)性能?？紫堵屎筒牧系挠H水性相關(guān)，通?？紫堵试礁撸牧系奈示驮礁?，生物相容性就越高。本課題所制備的多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架孔隙率為（64.73±5.65）%，抗拉強(qiáng)度（8.923 1±0.901 2）N/mm2，能夠同時具有較高的力學(xué)強(qiáng)度和孔隙率，高強(qiáng)度可能來源于BC的本身的優(yōu)良物理機(jī)械性能和支架制備時PLGA溶液滲透入BC內(nèi)部立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與其牢固結(jié)合有關(guān)，高孔隙率可能和BC本身的高親水性和支架的多孔結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此有望用于修復(fù)人體功能和負(fù)荷區(qū)。

本實驗將成骨樣細(xì)胞MG-3植于多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架上體外培養(yǎng)5天后電鏡掃描結(jié)果顯示：細(xì)胞能夠緊密黏附并有所伸展，達(dá)到一定程度的匯合并已開始增值，表明細(xì)胞生長狀況良好。MTT檢測結(jié)果顯示培養(yǎng)1 d后多孔BCPLGA-HA組與對照組組間數(shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可能是因為在接種早期MG-3細(xì)胞處于潛伏適應(yīng)期，支架材料對其增殖的影響作用尚未發(fā)生；培養(yǎng)3～5 d，多孔BC-PLGAHA組細(xì)胞增殖速度明顯快于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在培養(yǎng)5 d后測量MG-3細(xì)胞內(nèi)ALP的活性發(fā)現(xiàn)：多孔BC-PLGA-HA組細(xì)胞內(nèi)的ALP的合成量明顯高于對照組。說明多孔BC-PLGA-HA復(fù)合支架更有利于MG-3細(xì)胞的增殖和成骨分化。

綜上所述，本課題采用溶劑澆鑄法制備的多孔BC-PLGAHA復(fù)合支架具有良好的力學(xué)性能、孔隙率和生物相容性，有望作為修復(fù)功能區(qū)和負(fù)載區(qū)的生物材料，為組織工程支架材料提供新的選擇和思路。針對缺點與不足，實驗在支架的制備、理化性能和生物相容性方面進(jìn)行了初步的探討，有關(guān)復(fù)合支架其他相關(guān)性能、支架成分對支架本身性能的影響等方面內(nèi)容，還需要進(jìn)更多的實驗來進(jìn)行分析和討論。

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