李 艷，彭艷紅

（湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧437100）

蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)重要的生物大分子、功能分子，具有運(yùn)載和儲(chǔ)存功能[1～3］。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，藥物進(jìn)入血漿后，首先與血清白蛋白結(jié)合，然后再被運(yùn)送到身體的各部位發(fā)揮藥效[4～6］。各種金屬離子進(jìn)入人體一般需要通過血漿的儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)竭_(dá)受體部位，產(chǎn)生藥理作用。研究金屬離子與血清白蛋白的相互作用，對(duì)了解金屬離子的作用機(jī)制具有重要意義。熒光法研究金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合，靈敏度高、選擇性好、操作簡便易行，是應(yīng)用最普遍的研究手段之一。

Zn與Mn都是人體必需的元素。Zn能構(gòu)成一些酶的活性部位，催化多種化合物的水解、水合和脫羧等反應(yīng)[7］；若缺少 Mn會(huì)使人智力低下、發(fā)育不良[8］。作者在此首先采用熒光猝滅法研究Mn（Ⅱ）與牛血清白蛋白（BSA）的結(jié)合作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究 Mn（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合競爭。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA），分子量68 000，華美公司；Tris－Base（生化試劑）；氯化錳、氯化鋅、鹽酸、氯化鈉等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

帶恒溫系統(tǒng)的F－4500型熒光光度計(jì)，日本日立公司；PHS－3C型數(shù)字式酸度計(jì)，上海今邁儀器儀表公司；AYU120型分析天平，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

配制不同溫度（T＝298K、302K、306K、310K）下pH＝7.4的Tris－HCl緩沖溶液；在2cm的比色皿中分別加入2mL 1×10－5mo1·L－1的BSA溶液和不同量的Mn（Ⅱ）溶液，得不同比例（物質(zhì)的量之比）的Mn（Ⅱ）－BSA系列溶液。同法配制不同比例的Zn（Ⅱ）－BSA 系列溶液、不同比例的 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）系列溶液。

1.2.2 熒光光譜的測定

（1）Mn（Ⅱ）－BSA體系的熒光光譜測定：選定激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0nm，激發(fā)波長為295nm，在300～500nm波長范圍內(nèi)掃描并繪制不同濃度Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的熒光猝滅光譜；固定△λ＝15nm或△λ＝60nm，在一定波長范圍內(nèi)掃描BSA和 Mn（Ⅱ）－BSA體系，記錄Mn（Ⅱ）作用于BSA的同步熒光光譜（測定溫度為298K）。

（2）Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）體系的熒光光譜測定：選定激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0nm，激發(fā)波長為295nm，在300～500nm波長范圍內(nèi)掃描并繪制不同比例Zn（Ⅱ）－BSA和 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）的熒光猝滅光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的熒光猝滅特征

BSA是內(nèi)源性熒光物質(zhì)，其分子中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等芳香性氨基酸殘基能夠發(fā)射熒光。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸因發(fā)色團(tuán)不同而有著不同的熒光光譜，其最大的熒光發(fā)射峰分別位于340nm、305nm和282nm，其中色氨酸的熒光強(qiáng)度最大、苯丙氨酸的最小。故BSA的內(nèi)源熒光主要來自于色氨酸和酪氨酸。

本實(shí)驗(yàn)以295nm作為體系的激發(fā)波長，是為了降低酪氨酸和苯丙氨酸的影響，從而使牛血清白蛋白的熒光主要來自色氨酸殘基。

固定BSA的量，考察Mn（Ⅱ）對(duì)BSA熒光光譜的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 Mn（Ⅱ）對(duì)BSA熒光光譜的影響Fig.1 Quenching of BSA fluorescence spectra by adding Mn（Ⅱ）

由圖1可知，隨著Mn（Ⅱ）濃度的增大，BSA的最大熒光峰位置不變，但熒光強(qiáng)度卻降低。說明Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合較強(qiáng)。

2.2 熒光猝滅機(jī)理的確定

熒光猝滅通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種，動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑分子和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用引起的，猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大；靜態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)光的配合物引起的，猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小。在動(dòng)態(tài)猝滅過程中，猝滅劑和熒光物質(zhì)之間的相互作用遵循 Stern－Volmer方程[9］。即：

式中：F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；[Q］為猝滅劑的濃度，mol·L－1；KSV為Stern－Volmer猝滅常數(shù)，L·mol－1。

分別測定不同溫度（T＝298K、302K、306K、310 K）下，Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的熒光猝滅情況，繪制（F0／F）－1～[Q］曲線，如圖2所示。

由圖2可知，Mn（Ⅱ）對(duì)BSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線具有良好的線性關(guān)系。表明Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的熒光猝滅符合動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)理。

按式（1）計(jì)算出不同溫度下的KSV，結(jié)果見表1 。

表1 pH＝7.4時(shí)，不同溫度下 Mn（Ⅱ）－BSA體系的KSV、ΔGθ、ΔHθ、ΔSθ、Kb、n，R，SDTab.1 With pH＝7.4，the KSV，ΔGθ，ΔHθ，ΔSθ，Kb，n，R，SD for Mn（Ⅱ）－BSA system at different temperatures

由表1 可知，Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大，這進(jìn)一步說明了Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的熒光猝滅屬于動(dòng)態(tài)猝滅。

2.3 作用力類型的確定

有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力。若ΔH＞0、ΔS＞0，為疏水作用力；若ΔH＜0、ΔS＜0，為氫鍵和范德華力；若ΔH≈0、ΔS＞0，為靜電引力。

假設(shè)在測定溫度范圍內(nèi)焓變變化不大，則它的焓變?chǔ)和熵變△S可以從Vant－Hoff方程求得：

式中K類似于相應(yīng)溫度下Stern－Volmer方程中的猝滅常數(shù)KSV。

自由能變△G由下式求得：

以lnK對(duì)1／T作圖，如圖3所示。

圖3 Vant－Hoff曲線Fig.3 Vant－Hoff Plot

根據(jù) Vant－Hoff曲線及式（3）計(jì)算出 Mn（Ⅱ）與BSA相互作用的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù) ΔGθ、ΔHθ、ΔSθ的值，見表1 。

由表1 可知，該反應(yīng)ΔG＜0，表明反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；同時(shí)TΔSθ＞ΔHθ，表明 Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合主要是熵驅(qū)動(dòng)；ΔH＞0、ΔS＞0，表明 Mn（Ⅱ）與BSA之間的作用力主要為疏水作用力。

2.4 表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)其表觀結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)由下式求出：

式中：n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；Kb為表觀結(jié)合常數(shù)[10］。

繪制不同溫度下的lg[（F0／F）－1］～lg[Q］曲線，如圖4所示。

圖4 lg[（F0／F）－1］～lg[Q］曲線Fig.4 lg[（F0／F）－1］～lg[Q］Plots

依lg[（F0／F）－1］～lg[Q］直線的斜率和截距即可求出Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及表觀結(jié)合常數(shù)Kb，結(jié)果見表1 。

由表1 可知，在298K、302K、306K、310K時(shí)，相關(guān)系數(shù)R大于0.99，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，說明 Mn（Ⅱ）與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)所儲(chǔ)存和運(yùn)輸。

2.5 Mn（Ⅱ）對(duì)BSA構(gòu)象的影響

△λ＝15nm和△λ＝60nm所得到的同步熒光光譜分別顯示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光光譜特征。因氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，故由發(fā)射波長的改變可判斷BSA構(gòu)象變化。

固定BSA濃度，逐漸增大Mn（Ⅱ）的濃度，記錄△λ＝15nm和△λ＝60nm時(shí)BSA的同步熒光光譜，結(jié)果如圖5所示。

圖5 △λ＝15nm（a）和△λ＝60nm（b）時(shí)，BSA的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of BSA atΔλ＝15nm（a）andΔλ＝60nm（b）in the presence of Mn（Ⅱ）

由圖5可知，BSA的熒光主要由色氨酸殘基貢獻(xiàn)，Mn（Ⅱ）的加入并未改變BSA的構(gòu)象。

2.6 Zn（Ⅱ）對(duì)BSA的熒光猝滅特征

按照測定Mn（Ⅱ）的方法測定Zn（Ⅱ）與BSA的相互作用。固定BSA體積，逐漸加入一定濃度的Zn（Ⅱ），測其熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，Zn（Ⅱ）濃度對(duì)BSA的熒光強(qiáng)度影響非常小，可知Zn（Ⅱ）不會(huì)對(duì)BSA產(chǎn)生熒光猝滅。

2.7 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）的熒光猝滅特征

考察Mn（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）對(duì)BSA熒光光譜的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 Mn（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）對(duì)BSA熒光光譜的影響Fig.6 Quenching of BSA fluorescence spectra by adding Mn（Ⅱ）and Zn（Ⅱ）

由圖6可知，雙金屬體系會(huì)對(duì)BSA熒光光譜產(chǎn)生猝滅效應(yīng)；隨著金屬離子濃度的增大，熒光強(qiáng)度降低，但BSA的最大熒光峰位置不變。與Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的影響比較，雙金屬離子的影響要小很多，因?yàn)閆n（Ⅱ）不會(huì)對(duì)BSA產(chǎn)生猝滅效應(yīng)，說明Zn（Ⅱ）的加入會(huì)競爭Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合。

2.8 Zn（Ⅱ）和 Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合競爭的討論

2.8.1 單金屬體系與雙金屬體系的KSV分析

在298K、pH＝7.4的條件下分別測定 Mn（Ⅱ）－BSA體系與 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）體系的熒光猝滅光譜，按式（1）計(jì)算出 Mn（Ⅱ）－BSA單金屬體系和 Mn（Ⅱ）－BSA－Zn（Ⅱ）雙金屬體系的 KSV分別為0.1025×104L·mol－1、0.0498×104L·mol－1，雙金屬體系的KSV小于 Mn（Ⅱ）－BSA單金屬體系。說明Zn（Ⅱ）會(huì)對(duì)Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合產(chǎn)生競爭。

2.8.2 單金屬體系與雙金屬體系的KD分析

由Stern－Volmer方程變形可得：

按式（5）求出 Mn（Ⅱ）－BSA 和Zn（Ⅱ）－BSA－Mn（Ⅱ）的離解常數(shù)KD分別為3.5×104、1.68×104?？梢钥闯觯瑑煞N體系中Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合都較強(qiáng)，但雙金屬體系中Mn（Ⅱ）與BSA的離解常數(shù)更小，說明Zn（Ⅱ）會(huì)對(duì)Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合產(chǎn)生競爭，可能會(huì)使剩下的 Mn（Ⅱ）與BSA結(jié)合更穩(wěn)定，不容易離解。

3 結(jié)論

應(yīng)用熒光光譜法研究 Mn（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合競爭，結(jié)果表明：

（1）Mn（Ⅱ）對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)理是動(dòng)態(tài)猝滅；

（2）Mn（Ⅱ）與BSA以摩爾比1∶1結(jié)合，結(jié)合過程主要是熵驅(qū)動(dòng)，相互作用力主要為疏水作用力；

（3）Mn（Ⅱ）在與BSA作用的過程中，主要是BSA的色氨酸發(fā)生熒光，Mn（Ⅱ）的加入不會(huì)改變BSA的構(gòu)象；

（4）Zn（Ⅱ）不會(huì)對(duì)BSA產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)；

（5）Zn（Ⅱ）會(huì)競爭 Mn（Ⅱ）與BSA 的結(jié)合，Zn（Ⅱ）與BSA結(jié)合穩(wěn)定性小于Mn（Ⅱ）與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性。

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