李學(xué)農(nóng)福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院/福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001

脂質(zhì)過氧化損傷是肝纖維化形成的重要病理因素，可以通過影響膠原代謝導(dǎo)致肝纖維化的形成。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，在氧化磷酸化的過程中可產(chǎn)生一定量的自由基，當(dāng)體內(nèi)抗氧化體系受到破壞時，線粒體就會因脂質(zhì)過氧化作用而受到損傷［1]。因此，保護(hù)線粒體功能的穩(wěn)定是抗肝纖維化治療的一個潛在的靶點。川芎嗪是從中藥川芎中分離提取的有效成分。大量研究證明，川芎嗪具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、清除自由基以及改善血液流變學(xué)等多方面的藥理作用，其體內(nèi)外實驗均證實川芎嗪具有確切的預(yù)防和治療肝纖維化的作用［2-5]。本研究建立在前期研究的基礎(chǔ)上，通過觀察川芎嗪對肝細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用，進(jìn)一步完善川芎嗪抗肝纖維化的機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠40只，雄性，體重200±20g，由上海斯萊克公司提供，許可證號：SCXK(滬)2007-0005)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，高壓滅菌墊料和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1星期。

1.2 藥物與試劑

四氯化碳為國產(chǎn)分析純、橄欖油 (山東魯花集團(tuán)有限公司);鹽酸川芎嗪 (山東濰坊制藥廠有限公司);DPH(sigma);堿性磷酸酶 (ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)半自動生化儀專用試劑盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、Na-K-ATP酶及、Ca2+-ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1 大鼠肝纖維化模型的建立

將40只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成5組，即正常組、模型組、川芎嗪低、中、高劑量組，每組8只。將CCl4配成50%橄欖油劑，模型組及給藥組大鼠按1 ml/kg體重每周腹腔注射3次，同時正常組腹腔注射同體積的生理鹽水，持續(xù)8周。自造模之日起，第3周開始用藥組每周6次以川芎嗪低 (20mg/kg)、中 (40mg/kg)、高(60mg/kg)灌胃給藥，正常及模型組灌胃同體積的蒸餾水。

2.2 肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP的測定

末次給藥后，將各組大鼠麻醉后頸總動脈取血，離心后分離血清，生化儀檢測大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶 (ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、堿性磷酸酶 (AST)的含量。

2.3 肝細(xì)胞線粒體的制備［6]

處死動物，迅速剖取肝臟，取一小塊肝組織，稱重后立即加入一定量的預(yù)冷生理鹽水，冰浴勻漿，10 s/次，間歇30 S，連續(xù)2～3次，然后定容，制成10%肝勻漿，3 000×g 4℃冷凍離心10 min，棄沉淀取上清液以12000×g 4℃冷凍離心15 min，沉淀物即為線粒體，于-20℃冷凍過夜，融化后進(jìn)行以下操作。

2.4 肝細(xì)胞線粒體內(nèi) MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶測定

收集的肝線粒體采用超聲波法裂解，裂解后線粒體均用Bradford法測定蛋白含量。丙二醛 (MDA)采用硫代巴比妥酸 (TBA)法，超氧化物歧化酶 (SOD)采用羥胺法，Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶采用比色法，均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.5 肝細(xì)胞線粒體膜的流動性測定

采用熒光標(biāo)記與熒光偏振法［7]。取線粒體3 ml，加入等體積DPH熒光探針液，混勻放25℃溫育30 min，再離心經(jīng)PBS洗滌1次，注入測試管。應(yīng)用熒光分光光度計，在激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長430nm測定膜熒光強(qiáng)度。膜脂流動性用熒光偏振度P、微粘度η表示，測量并記錄樣本的4個熒光強(qiáng)度。即 IVV、IVH、IHV、IHH，以 G(IHV/IHH)為校正因子。先按公式P=(IVV-GIVH)/(IVV+GIVH)計算出熒光偏振度P，再按公式η=2P/(0.46-P)計算出微粘度η。平均微粘度η越高，說明線粒體膜流動性越低，線粒體損傷越嚴(yán)重。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)表示，組間采用t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝纖維化大鼠造模結(jié)果

32只大鼠經(jīng)造模后給藥后，存活率為87.5%。其中，第2周死亡1例，第3周死亡1例，第6周死亡2例。死亡大鼠尸檢可見腹腔內(nèi)彌漫性化膿性炎癥，肝臟顏色晦暗，肝組織上附著大量白斑及膠原狀物質(zhì)，組織學(xué)觀察見肝組織廣泛大面積壞死并伴有中性粒細(xì)胞浸潤。

3.2 川芎嗪對大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP的影響

結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP水平顯著升高，具有極顯著差異 (P＜0.01)。而川芎嗪治療后，大鼠各項血清指標(biāo)均降低，且在川芎嗪高劑量組時，與模型組相比，各項指標(biāo)均具有顯著性差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 川芎嗪對大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP的影響 (SD)

表1 川芎嗪對大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP的影響 (SD)

注：與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，* P＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組別 N ALT(u/L) AST(u/L) ALP(u/L)8 30.25 ±3.08 99.70 ±13.41 218.36 ±14.07模型組 6 54.57 ±14.09##139.45 ±26.69## 294.77 ±45.88##川芎嗪低劑量組 7 47.81 ±16.77 134.43 ±9.07 285.22 ±35.67川芎嗪中劑量組 7 41.25 ±6.77* 117.31 ±8.84 251.67 ±17.19*川芎嗪高劑量組 8 37.41 ±7.85* 104.41 ±18.87* 229.68 ±38.61正常組*

3.3 川芎嗪對肝細(xì)胞線粒體內(nèi)MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的影響

結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組的SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的含量顯著降低，MDA的含量顯著升高，具有極顯著性的差異 (P＜0.01)。而川芎嗪治療組能夠顯著的升高SOD、Na-K+-ATP酶及 Ca2+-ATP酶的含量，并且有效降低MDA的含量，與模型組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 川芎嗪對肝線粒體內(nèi)MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的影響 (±SD)

表2 川芎嗪對肝線粒體內(nèi)MDA、SOD、Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的影響 (±SD)

注：與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，* P＜0.05，＊＊ P ＜0.01

2.63 ±0.14 105.51 ±9.44 6.84 ±1.09 5.96 ±0.44模型組 2.92 ±0.05##82.94 ±9.20## 4.97 ±0.26## 4.71 ±0.42##川芎嗪低劑量組 2.78 ±0.14 88.99 ±6.99 5.24 ±0.43 5.03 ±0.15川芎嗪中劑量組 2.71 ±0.15* 94.91 ±6.80* 5.63 ±1.08 5.51 ±0.53*川芎嗪高劑量組2.62 ±0.09＊＊99.38 ±7.99* 5.76 ±0.53* 6.48 ±0.39-ATP正常組組別 MDA SOD Na-K+-ATP Ca2+＊＊

3.4 川芎嗪對肝細(xì)胞線粒體膜流動性的影響

圖1 川芎嗪對肝線粒體膜流動性的影響

結(jié)果顯示，與正常對照比相比，模型組的線粒題膜微黏度顯著升高 (P＜0.01)，而經(jīng)過川芎嗪治療的大鼠的線粒體膜微黏度明顯降低，具有劑量依賴性。與模型組比較，川芎嗪高劑量組具有顯著性差異 (P＜0.05)，說明川芎嗪可以顯著提高肝纖維化大鼠線粒體膜的流動性。見圖1。

4 討論

肝纖維化 (Hepatic Fibrosis)是肝細(xì)胞損傷后的修復(fù)機(jī)制，是多種慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必由之路。研究表明，肝損傷導(dǎo)致體內(nèi)自由基增多，引起肝臟脂質(zhì)過氧化參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。CCl4為親肝性毒物，能夠?qū)е麦w內(nèi)自由基增加，引起脂質(zhì)過氧化，故本研究采用CCl4制作動物肝纖維化模型。其結(jié)果顯示 CCl4模型血清中ALT、AST、ALP的含量明顯高于正常組，而川芎嗪可以有效的減少以上各項指標(biāo)。為了探討其抗肝纖維化的具體的機(jī)制，我們分離了肝細(xì)胞線粒體進(jìn)行以下研究。

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在體內(nèi)膠原基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用，它是連結(jié)組織損傷與纖維化兩個過程的紐帶［8]。線粒體是細(xì)胞能量的主要來源，與氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞死亡進(jìn)程的調(diào)控有關(guān)。許多毒物可以通過脂質(zhì)過氧化作用對線粒體膜、膜蛋白及線粒體DNA造成損傷。SOD是細(xì)胞內(nèi)天然的氧自由基清除劑，而MDA則是氧自由基與細(xì)胞膜表面不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物，因此MDA與SOD構(gòu)成了一對反應(yīng)組織脂質(zhì)過氧化和抗脂質(zhì)過氧化的特征指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，肝纖維化大鼠線粒體中的MDA含量明顯升高，SOD的活性顯著降低，而川芎嗪給藥組可以有效的逆轉(zhuǎn)以上各項指標(biāo)。Na-K+-ATP酶及 Ca2+-ATP酶是生物體內(nèi)廣泛存在的一種極為重要的膜酶，二者對維持線粒體膜的正常功能具有十分重要的作用。本實驗結(jié)果顯示，肝纖維化大鼠的肝細(xì)胞線粒體中Na-K+-ATP酶及 Ca2+-ATP酶的活性明顯降低，在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，抗自由基損傷的作用減弱，其線粒體膜的微黏度升高，線粒體損傷嚴(yán)重。而川芎嗪可以可減輕肝纖維化過程中脂質(zhì)過氧化和自由基損傷，恢復(fù)Na-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性，增加線粒體膜的流動性，保護(hù)線粒體的脂質(zhì)過氧化作用，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程。

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