彭麗華 劉嘉煒 鄭家概 成金樂 冼美廷

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，教育部 (省部共建)中藥資源科學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510006;2.廣東省中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 中山 528437;3.廣東省廣州分析測試中心，廣東 廣州 510070

露兜簕為露兜樹屬植物露兜樹PandanuSTectorius Soland的干燥根和根莖。露兜簕在嶺南地區(qū)廣泛用于民間傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，具有平肝清熱，去濕利尿，發(fā)汗解表，行氣止痛的功效，用于治感冒發(fā)熱，風(fēng)濕痹痛，肝火頭痛，肝炎、肝硬化腹水，尿路感染，腎炎水腫，眼結(jié)膜炎，跌打損傷等病癥［1-2]。露兜簕作為一種民間草藥在嶺南地區(qū)使用已有悠久歷史，并收載于廣東地方藥材2011年版。但有關(guān)露兜簕的現(xiàn)代藥理學(xué)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究報道有限。早期植物化學(xué)研究表明含有豆甾醇和脂肪酸等化學(xué)成分［3]。最近我們課題組從露兜簕醇提取物中分離鑒定出一組新結(jié)構(gòu)環(huán)木菠蘿烷三萜化合物 (研究結(jié)果另文發(fā)表)。但尚未見對露兜簕氨基酸和無機(jī)微量元素分析測定的報道。為了從多途徑探索該藥用植物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究分析測定了露兜簕各種氨基酸和無機(jī)微量元素的種類和含量，共檢測出16種氨基酸和20種無機(jī)微量元素，旨在為露兜簕的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供基礎(chǔ)證據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 露兜簕收集于廣東省陽江市陽西縣程村鎮(zhèn)紅光村，經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園葉華谷教授鑒定為露兜樹屬植物露兜樹 (PandanuSTectorius Soland)的根和根莖。露兜簕常溫陰干，取適量藥材用粉碎機(jī)粉碎，過五號篩，60℃烘干至恒重，放置干燥器中備用。

1.2 儀器 全譜直讀等離子體原子發(fā)射光譜儀 (IRIS Advantage，美國 Thermo Jarrell Ash Corporation);AL204型電子天平 (瑞士METFLER TOLEDO);Agilent1100型高效液相色譜儀

1.3 試劑 氨基酸對照品、衍生試劑ortho-Phthalaldehyde(OPA)及Fluorene methoxycarbonyl(FMOC)購自SIGMA公司;硝酸，高氯酸，Na2HPO4等試劑均分析純;甲醇和乙腈為HPLC級。

2 方法

2.1 氨基酸含量測定

2.1.1 樣品處理 準(zhǔn)確稱取0.2 g露兜簕干燥粉末置水解管中，加入2 mL HCl(6 M)，滴加兩滴新蒸餾的苯酚，將水解管置于冷凍劑中，冷凍3～5 min，抽真空，充入氮氣，再抽真空，充氮氣，在充氮氣狀態(tài)下封口，置110℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解23 h后，取出冷卻。將水解液濾過，去離子水多次洗滌水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入堿中和多余的酸后，去離子水定容。樣品平行重復(fù)3次。

2.1.2 衍生化 衍生在HP1050自動進(jìn)樣器上在線自動完成，程序如下： (1)吸取2.0 μL硼酸鹽緩沖液 (pH=10.5); (2) 吸取 2.0 μL OPA; (3) 吸取 1.0 μL 樣品;(4) 混合 5 次; (5) 等待 1.00 min; (6) 吸取 1.0 μL FMOC;(7)混合5次;(8)等待1.00 min;(9)進(jìn)樣。

2.1.3 液相色譜 Hypersil ODS色譜柱 (4.0×125 mm，粒徑5 μm); 流動相 (A)：Na2HPO4緩沖液 (PB，10 Mm，pH=7.2); 流動相 (B) ∶PB ∶MeOH∶MeCN(50∶35∶15)。線性梯度：在0～25 min內(nèi)，流動相B以線性從0%上升至100%。流速：1.0 mL/min;柱溫40℃;檢測波長：0 min時，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm，檢測一級氨基酸的OPA衍生物;20.5 min后，將波長切換至激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長305 nm檢測二級氨基酸 (脯氨酸)的FMOC衍生物，結(jié)果見表1。

表1 露兜簕根和根莖的各種氨基酸含量分析結(jié)果 (n=3，μg/g)

2.2 無機(jī)微量元素測定 精密稱取露兜簕粗粉 (0.5 g)，置凱氏燒瓶中，加5-l0 mL的硝酸-高氯酸 (4∶1)混合溶液，混勻，微波消解至溶液澄明，冒濃煙，最后消解液呈無色透明或略帶黃色，放冷，用2%硝酸溶液轉(zhuǎn)溶消解液至50 mL量瓶中，并加水定容稀釋至刻度，搖勻，即得。每份樣品平行重復(fù)3次，同法制備空白溶液。全譜直讀等離子體原子發(fā)射光譜儀測定樣品，結(jié)果見表2。

表2 露兜簕根和根莖中多種無機(jī)微量元素含量 (n=3，μg/g)

3 結(jié)果

3.1 氨基酸組成和含量 從表1中可見，露兜簕藥材共檢測到16種氨基酸，其中7種人體必需氨基酸，分別為亮氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，蛋氨酸及纈氨酸;含量較高的氨基酸有谷氨酸 (1.5μg/g)、天門冬氨酸 (1.3μg/g) 和亮氨酸 (1.0μg/g); 含量最低是蛋氨酸(0.1μg/g)。

3.2 無機(jī)微量元素種類和含量測定 采用等離子體原子發(fā)射光譜法檢測露兜簕粉末硝化產(chǎn)物，從表2中可見，共檢測出K、Ca、Mg、Si和 Sr等20種微量元素，其中含有Mg、Fe、Mn、Cr、Zn、Cu、Ni六種人體必需微量元素，含有Cd、Al、Pb三種有害重金屬元素。

4 討論

4.1 本研究采用柱前衍生液相色譜法分析露兜簕水解氨基酸，共分析檢測出16種氨基酸，總含量為10.5μg/g。其中亮氨酸，異亮氨酸和賴氨酸等7種人體必需氨基酸占其氨基酸總量的37%以上，可見露兜簕所含氨基酸的種類和含量都比較豐富。

4.2 本研究利用等離子體原子發(fā)射光譜法檢測露兜簕粉末硝化產(chǎn)物，共分析出Fe、Mn和Cr等二十種無機(jī)微量元素。其中Fe、Mn、Cr、Zn、Ni、Cu為人體必需微量元素，且鐵和錳的含量分別達(dá)358 μg/g和52.8 μg/g。微量元素對維持人體的新陳代謝是必不可缺的。研究表明中藥藥性藥效與微量元素種類及其含量有關(guān)［4]。本文實驗數(shù)據(jù)提示露兜簕所含無機(jī)微量元素在人體內(nèi)可能具有某些生理和藥理活性。此外，露兜簕藥材中還檢測到Cd(0.4 μg/g) 和Pb(16.0 μg/g)等有害重金屬元素［5]。為了保證藥材飲片的質(zhì)量和用藥安全性，露兜簕藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)考慮Cd和Pb等有害重金屬元素的檢測。

綜上所述，露兜簕藥材含有較豐富的人體必需氨基酸和無機(jī)微量元素，本論文實驗數(shù)據(jù)可為露兜簕藥材藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

［1]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M].上海科學(xué)技術(shù)出版社，1975：3863-3864.

［2]中國科學(xué)院華南植物研究所.廣東植物志 (第六卷) ［M].廣東科技出版社，1995：400-402.

［3]彭麗華，成金樂，詹若挺，等.露兜樹屬植物的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J].中藥材，2010，33(4)：640-643.

［4]秦俊法.中國的中藥微量元素研究［J].廣東微量元素科學(xué)，2011，18(1)：1-10.