苑保國，李素暖，高 靜

（1.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130；2.衡水學(xué)院分院 機(jī)械電子系，河北 衡水 053000）

乳酸乙酯為無色透明液體，具有酯類物質(zhì)特有的香味，是白酒中香味來源的重要組分之一[1].另外，乳酸乙酯具有無毒、溶解性好、不易揮發(fā)、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，為環(huán)境友好溶劑，很多有毒的工業(yè)溶劑可以用它取代[2].乳酸乙酯在食品、醫(yī)藥及化妝品行業(yè)都得到廣泛的應(yīng)用[3].目前，工業(yè)上乳酸乙酯的生產(chǎn)主要采用傳統(tǒng)的濃硫酸催化酯化法，該方法具有腐蝕性強(qiáng)、副反應(yīng)多、產(chǎn)品質(zhì)量差等諸多缺點(diǎn)[4].目前，許多研究集中在用固體酸作為催化劑[5-6]，但是，固體酸的制備需要的溫度非常高，可控性較差.

酶催化具有反應(yīng)活性高、反應(yīng)條件溫和、后處理簡單、無污染等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用酶法催化合成乳酸乙酯有望從根本上解決乳酸乙酯傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的弊端.國內(nèi)外已有酶法合成各種乳酸酯和脂肪酸乙酯的報(bào)道[7]，最近的報(bào)道也主要集中于乳酸與其它脂肪酸的反應(yīng)或糖酯的合成[8-9].目前，關(guān)于酶法催化合成乳酸乙酯的報(bào)道還很少[10]，所用的酶是商業(yè)化固定化酶，成本相對較高.

本文利用自制的固定化南極假絲酵母脂肪酶B（Candida Antarctic LipaseB）為催化劑，催化乳酸乙酯的合成.利用Plackett-Burman及響應(yīng)曲面（RSM）法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化固定化酶催化合成乳酸乙酯的反應(yīng)條件.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）購自Sigma公司.固定化CALB（自制：采用離子液體為保護(hù)劑，溶膠-凝膠法固定化）.正硅酸乙酯（TEOS），SiO2含量≥28.0%；乳酸（經(jīng)濟(jì)型）；無水乙醇均為天津市科密歐化學(xué)試劑研究中心產(chǎn)品.[Dm im]BF4，純度97%，上海成捷化學(xué)有限公司生產(chǎn).實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

旋渦混合儀（XW-80A，上海滬西分析儀器廠）；SP-2100氣相色譜儀（北京分析儀器廠）；恒溫水浴振蕩器（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）.

1.2 固定化酶的制備

按4.5∶1.4∶0.1的體積比移取TEOS溶液、蒸餾水和0.1mol/L的HCl溶液于50m L錐形瓶內(nèi)混合，置于微型漩渦混合儀上混合振蕩數(shù)小時(shí)后形成均勻透明的混合溶液，得到空白溶膠溶液.取400空白溶膠，緩慢加入一定量的 [ Dm im]BF4，迅速加入60的酶溶液 ( 含游離酶1 mg)于漩渦混合儀上振蕩形成均勻混合體.將此體系置于4℃冰箱中老化1 d，再以室溫下老化.洗滌、干燥后得到固定化酶.

1.3 酶催化反應(yīng)

將乳酸和無水乙醇按一定比例加入到10 m L具塞錐形瓶中，充分混和后加入一份固定化酶，置于恒溫振蕩水浴搖床中，在特定的溫度和搖床轉(zhuǎn)速下反應(yīng)一定時(shí)間.

1.4 產(chǎn)物分析

乳酸乙酯含量的測定采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，氣相色譜儀為SP-2100型，色譜柱為填充柱（8%甲基苯基硅烷于80～100目白色擔(dān)體上，柱長2m，內(nèi)徑3mm）.柱箱溫度120℃，檢測室和氣化室溫度分別為160℃和170℃，內(nèi)標(biāo)物為環(huán)己酮.色譜分析圖如圖1所示.

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選重要因素

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)主要目的是在眾多的影響因子中篩選出對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大的因素，利用該方法可以有效地減少試驗(yàn)次數(shù)[11-14].選擇高低兩個(gè)水平，低水平編碼為 1，高水平編碼為1.

以乳酸乙酯產(chǎn)率（Y）值作為響應(yīng)值，以搖床轉(zhuǎn)數(shù)（X1）、反應(yīng)溫度（X2）、乳酸與無水乙醇的物質(zhì)的量之比（X3）、底物總質(zhì)量（X4）及反應(yīng)時(shí)間（X5）等影響因素為考察對象.采用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=8的 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，各因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和表2.

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)各因素水平Tab.1 Levelsof independentvariable in Placket-burman design

從表3可以看出，在所考查的5個(gè)因素中，X1（轉(zhuǎn)數(shù)）、X4（底物總質(zhì)量）、X5（反應(yīng)時(shí)間）對乳酸乙酯產(chǎn)率影響較大，是主要影響因素，在95%概率水平上影響顯著.其中底物總質(zhì)量為正效應(yīng)，應(yīng)增加；轉(zhuǎn)數(shù)、反應(yīng)時(shí)間為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小.X2（溫度）的影響為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)當(dāng)取其低水平，X3（酸醇物質(zhì)的量之比）的影響為正效應(yīng)，取其高水平.根據(jù)Placket-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步確定影響較小因素的水平：溫度為50℃，乳酸與無水乙醇的物質(zhì)的量之比為1∶8，且在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不再改變.

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Tab.2 Placket-burman design and experiment results

表3 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)中各因素的效應(yīng)分析Tab.3 Effectanalyses from Placket-Burman design

通過逐步回歸分析，獲得回歸方程為

排除非顯著性因素，得到最終的回歸方程為

式中Y為乳酸乙酯產(chǎn)率的預(yù)測值.該模型的相關(guān)系數(shù)R2=92.8%.

2.2 響應(yīng)曲面法對實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

響應(yīng)曲面法綜合了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模，它可以通過局部實(shí)驗(yàn)，回歸實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系[11,15].中心組合設(shè)計(jì)（centralcompositedesign）是一種最為常用的響應(yīng)曲面方法.該方法可以利用有限的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，評價(jià)各因子的影響，并能分析各因子之間相互作用的程度.根據(jù)實(shí)驗(yàn)值可以得到各因素水平及其相互作用與響應(yīng)值之間的二次多項(xiàng)式，通過回歸此式可以對各因子進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳組合.用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸方法，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到如下二次多項(xiàng)式

該方程是描述應(yīng)變量Y與自變量x的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?對此方程代表的面進(jìn)行分析，可以推測出最適操作條件在實(shí)驗(yàn)所覆蓋的區(qū)域，獲得優(yōu)化乳酸乙酯產(chǎn)率的最佳條件組合.

由 P lackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：反應(yīng)溫度為50℃，乳酸與無水乙醇的物質(zhì)的量之比為1∶8比較適宜.乳酸乙酯的產(chǎn)率受搖床轉(zhuǎn)數(shù)、底物總質(zhì)量及反應(yīng)時(shí)間影響較大.為此，以搖床轉(zhuǎn)數(shù)（X1）、底物總質(zhì)量（X2）及反應(yīng)時(shí)間（X3）為自變量，乳酸乙酯的產(chǎn)率（Y）為響應(yīng)值，選用三因素五水平的中心組合實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼見表4，試驗(yàn)結(jié)果見表5.

利用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以得到回歸系數(shù)，建立響應(yīng)值方程見式 ( 2)

表4 中心組合設(shè)計(jì)因素編碼水平Tab.4 Leveland code ofexperimentvariables

表5 中心組合設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Central composite design and itsexperiment results

表6 回歸分析Tab.6 Regression analysisof the central composite design

該模型的決定系數(shù) (R-Squared)為87.17%，表明該模型可以解釋87.17%的可變性，Adeq Precision是用來測量噪音比率的信號，當(dāng)該比率大于4時(shí)比較理想，該模型的Adeq Precision值為9.392，說明該模型能夠很好的指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).

為了更清晰地表明各影響因素之間的交互作用對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響，分析了其3D圖（圖2）.圖2顯示了搖床轉(zhuǎn)速、底物總質(zhì)量以及二者之間的交互作用對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響（反應(yīng)時(shí)間24 h）.由圖1可以看出，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速較低時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，乳酸乙酯的產(chǎn)率也增大，但當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過大時(shí)，乳酸乙酯的產(chǎn)率反而降低.主要是由于轉(zhuǎn)速過低時(shí)，使得底物與固定化酶之間的傳質(zhì)受到影響，酶的活性不能充分發(fā)揮；轉(zhuǎn)速過高時(shí)，由于機(jī)械力的作用，容易引起酶失活，使酶的催化活性降低，乳酸乙酯產(chǎn)率反而下降.

圖3顯示不同轉(zhuǎn)速及反應(yīng)時(shí)間對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響由（底物總質(zhì)量為0.9 g）.隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，乳酸乙酯的產(chǎn)率增大.主要是由于酶固定化以后受到擴(kuò)散效應(yīng)的影響使其催化反應(yīng)動力學(xué)發(fā)生改變，需要較長時(shí)間達(dá)到反應(yīng)平衡，因此，在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，乳酸乙酯的產(chǎn)率也增大，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，反應(yīng)已接近平衡，產(chǎn)率變化不大.搖床轉(zhuǎn)速對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響與圖2相吻合.

圖4表明了不同反應(yīng)時(shí)間、底物總質(zhì)量以及二者交互作用對乳酸乙酯產(chǎn)率的影響（搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min）.隨著反應(yīng)時(shí)間以及底物總質(zhì)量的增加，乳酸乙酯的產(chǎn)率也增大，但反應(yīng)時(shí)間的影響要小于底物總質(zhì)量的影響.這表明乳酸乙酯的產(chǎn)率很大程度上受到底物總質(zhì)量的影響.分析原因可能是一方面由于底物量過少時(shí)使得酶與底物不能充分接觸，影響反應(yīng)速率；另一方面可能是由于底物較少時(shí)，底物量成為酶促反應(yīng)的限制因素，因此，研究酶催化反應(yīng)時(shí)一般要求底物過量，但如果底物過多時(shí)也會對酶產(chǎn)生抑制作用.

3 結(jié)論

本文對利用自制固定化南極假絲酵母脂肪酶 B（CALB）催化合成乳酸乙酯進(jìn)行了初步研究.利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面法優(yōu)化了反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)搖床轉(zhuǎn)速、底物總質(zhì)量以及反應(yīng)時(shí)間對乳酸乙酯產(chǎn)量有較大影響.搖床轉(zhuǎn)速較低時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，乳酸乙酯的產(chǎn)率增大，但當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過大時(shí)，乳酸乙酯的產(chǎn)率反而降低；隨著反應(yīng)時(shí)間以及底物總質(zhì)量的增加，乳酸乙酯的產(chǎn)率增大，但是反應(yīng)時(shí)間的影響要小于底物總質(zhì)量的影響.當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/m in、溫度為50℃、乳酸與無水乙醇的物質(zhì)的量之比為1∶8、底物總質(zhì)量為1.24g、反應(yīng)時(shí)間為24h的條件下，乳酸乙酯產(chǎn)率達(dá)38.15%.結(jié)果表明，利用自制固定化酶催化合成乳酸乙酯具有很大潛力.

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