張裕剛，龔興厚，吳述平，蔣久信，張高文，劉嘉寧

（湖北工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢430068）

可降解聚合物多孔支架的孔尺寸不僅對細胞的粘附、遷移和生長有重要影響，而且也會影響組織的生長和再生［1－2］.要滿足不同組織細胞的良好生長，則需要提供具有不同孔尺寸的支架［3］.為了研究不同孔尺寸對某一組織細胞生長情況的影響，研究者采用三維打?。?］、紡絲法［5］、離心法［6］、相分離法［7］、疊層法等方法制備了孔徑軸向／徑向梯度變化的多孔支架材料.在前期的研究中，本課題組采用溶劑澆鑄／真空揮發(fā)／粒子瀝濾法（solvent casting／vacuu m volatilization／porogen leaching，SC／VV／PL）制備了結(jié)構(gòu)均勻的三維多孔支架［9－10］.本方法不僅克服了傳統(tǒng)的SC／PL方法只能制備厚度2 mm左右的薄膜樣品的缺點，而且能更快更徹底地揮發(fā)掉有機溶劑.在此基礎(chǔ)上，還利用同一裝置，采取LBL方法制備了孔徑軸向梯度變化的多孔支架［11］.本研究依然采用前期研究工作中的主體裝置，借助不同內(nèi)徑的布氏漏斗作模具，經(jīng)過二次澆鑄工藝制備了孔徑、孔隙率徑向梯度變化的多孔支架，對支架孔的形貌、孔隙率和壓縮模量等進行研究.

1 實驗部分

1.1 實驗原料

聚乳酸（PLA），M（Mn）＝80 kg／mol，Tg＝57℃、Tm＝160℃，深圳市光華偉業(yè)實業(yè)有限公司；氯仿，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；無水乙醇，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司.Na Cl，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，經(jīng)分級篩研磨成粒徑范圍為：＜210μm；210～310μm；310～420μm.

1.2 梯度多孔支架的制備

本實驗采用改進的溶液澆鑄／粒子瀝濾法［9］制備孔徑徑向梯度變化的多孔支架（圖1）：實驗室的溫度控制在（27±2）℃，將篩分好的Na Cl顆粒加入PLA的氯仿溶液（質(zhì)量分數(shù)為10%）中，充分攪拌使Na Cl分散均勻；然后將糊狀的混合物小心轉(zhuǎn)入帶吸濾瓶的布氏漏斗中（圖1a），并用活塞密封漏斗，布氏漏斗中間放置的一端封閉的玻璃管是為了控制所成型的產(chǎn)物為圓筒狀樣品；裝置靜置20 min，待混合物的表面流平后，將吸濾瓶與真空泵連接，使剩下的溶劑在（0.08±0.01）MPa的壓力下從混合物的下表面揮發(fā)（圖1b）；待揮發(fā)完溶劑，從布氏漏斗中取出PLLA／NaCl復(fù)合物，移除玻璃管，得到圓筒狀樣品（圖1c）；然后將圓筒狀樣品再次放入另一較大內(nèi)徑的布氏漏斗中，在圓筒中加入第二種PLLA／CHCl3／Na Cl混合物，在圓筒與布氏漏斗之間填充第三種PLLA／CHCl3／NaCl混合物（圖1d）；再次經(jīng)靜置、真空揮發(fā)過程得到三層的PLLA／Na Cl復(fù)合物（圖1e、f）；將復(fù)合物浸入去離子水中，每4 h換一次水，直到置換出的水中用硝酸銀溶液檢測不到氯離子為止；最后將多孔支架置于鼓風(fēng)干燥機中30℃干燥24 h，再轉(zhuǎn)入真空干燥箱于30℃下干燥24 h，所有樣品存放于真空干燥器中避免降解.將樣品徑向從內(nèi)到外的三層分別記為L1、L2和L3，混合物中PLA用量、Na Cl用量和粒徑見表1.

圖1 制備原理圖

表1 不同層的NaCl孔徑及用量

為了準確測定各層的孔隙率、孔徑和力學(xué)性能，采用SC／VV／PL［10］方法、按各層的組成另外制備結(jié)構(gòu)均勻的三維支架樣品，利用這些組成均勻的樣品的性能來代表梯度材料各層的相關(guān)性能.

1.3 性能測試

采用液體置換法［11－12］測定支架的孔隙率.測試原理：將重量wdry干燥的多孔支架放入玻璃瓶中，連接真空泵抽真空，用注射器將乙醇注入玻璃瓶中，快速通入大氣，使乙醇在壓力作用下進入支架空隙，通過數(shù)次抽真空／通大氣過程使支架中空隙完全被乙醇占滿.然后將此支架放入一個預(yù)先已經(jīng)盛滿乙醇的稱量瓶中，稱重wwet，孔隙率

式中：wdry為支架干重；wwet為支架濕重；ρPLA為聚乳酸密度，1.270 g／mL；ρethanol為無水乙醇密度，0.790 g／mL.所測得的孔隙率結(jié)果均由軟件Orign 7.0分析得到其平均值和標準偏差.

從剖開的圓柱狀梯度樣品的中心部位取樣，使用TGA（Perkin－El mer TGA－7）檢測支架中溶劑和致孔劑的殘留質(zhì)量，試驗溫度為20～400℃，升溫速率10 K／min，氮氣流速為20 mL／min，樣品重量為12 mg，利用Per kin－El mer軟件計算微分熱失重曲線（DTGA）.

用手術(shù)刀沿圓柱橫截面切取2～3 mm厚的樣品，切面噴金，在20 k V下用掃描電子顯微鏡（JSM－6390LV，日本JEOL公司）下觀察支架橫截面的孔形貌；平均孔尺寸利用圖片分析軟件Nano measurer 1.2.5對SEM 照片進行分析得出.

用鉆孔器鉆取直徑13.0 mm，高度15.0 mm的圓柱形樣品，利用材料蠕變試驗機（Creep Testing Machine，CMT－4204，MTS SYSTEMS CO.LTD）在室溫下測試支架的壓縮彈性模量，每組測試5個樣品取平均值并分析其標準偏差.

2 結(jié)果與討論

圖2為PLA原料和梯度支架樣品的TGA與DTGA曲線，PLA原料和多孔PLA支架的TGA與DTGA曲線非常類似，最大熱失重速率均在270～400℃之間，當溫度達到400℃時，重量損失均約為100%，這一結(jié)果說明多孔支架中沒有明顯的致孔劑和溶劑殘留.在以往研究中，本方法所制備的多孔支架經(jīng)MTT法檢測也證實不具有細胞毒性［10］.

圖2 PLA原料和梯度支架樣品

圖3為支架掃描電鏡照片，由從圓心向圓周拍攝的多張圖片組合而成.從圖中可以看出：支架斷面上均勻分布著大小不同的孔，且孔與孔之間具有良好的相互連通性；孔徑從圓心到圓周逐漸變大，呈現(xiàn)明顯的梯度結(jié)構(gòu)；在層與層之間不存在明顯的界限.由此可見本方法能夠成功制備出孔徑梯度變化的多孔支架.

圖3 支架掃描電鏡照片

圖4是梯度多孔支架不同層的應(yīng)力－應(yīng)變曲線.在較小應(yīng)力作用下，材料顯示線性彈性行為，當應(yīng)變繼續(xù)增大（30%～40%），應(yīng)力較為均勻地增加，但應(yīng)變大于40%后，應(yīng)力迅速增加.梯度支架不同層的平均孔徑、孔隙率及壓縮模量如圖5所示.

圖4 支架不同層的應(yīng)力－應(yīng)變曲線

圖5 支架不同層的平均孔徑、孔隙率及壓縮模量

從圖中可以看出：孔徑與所采用的Na Cl粒徑相符，說明支架中的孔是由Na Cl粒子濾除后形成，由此證明可以根據(jù)組織工程的需要，通過控制Na Cl粒徑來控制梯度支架不同層的孔徑；由圓心到圓周的L1、L2、L3層的孔隙率分別為（87.9±1.2）%、（91.4±0.9）%和（94.9±0.5）%，由此可知不同層的孔隙率可以通過致孔劑的用量進行調(diào)節(jié)，但如果致孔劑所占質(zhì)量分數(shù)太少時，難以完全從支架中濾除；從圓心到圓周，各層的壓縮模量呈下降趨勢，這主要是由于孔隙率增大造成的.另外，孔徑增大導(dǎo)致支架質(zhì)量分布不均勻，也會對支架力學(xué)性能帶來不利影響.

3 結(jié)論

采用改進的SC／PL法成功制備了孔徑、孔隙率徑向梯度變化的三維多孔支架，梯度材料各層的孔徑、孔隙率可通過調(diào)節(jié)致孔劑的尺寸及用量進行控制，且支架孔與孔間具有良好的相互連通性；梯度多孔支架的壓縮模量處于（1.96±0.24）～（2.40±0.1）MPa之間，致孔劑用量和致孔劑粒徑的變化均會導(dǎo)致支架力學(xué)性能的變化；TGA測試結(jié)果證實支架不存在致孔劑和溶劑殘留.

［1］Tienen T G，Heijkants R G，Bu ma J CP，etal.Tissue ingrowt h and degradation of two biodegradable porous poly mers with different porosities and pore sizes［J］.Bio materials，2002，23：1 731－1 738.

［2］Yang S，Leong K F，Du Z，etal.The design of scaff olds for use in tissue engineering.Part I：traditional factors［J］.Tissue eng，2001，7：679－689.

［3］Oh S H ，Par k L K，Ki m J M ，etal.In vitr o and in rivo characteristics of PCL scaff olds with pore size gradient fabricated by a centrif ugation method［J］.Bio materials，2007，28：1 664－1 671.

［4］Vassilis K，David K.Porosity of 3D biomaterial scaff olds and osteogenesis［J］.Biomaterials，2005，26（27）：5 474－5 491.

［5］Harley A B，Hastings A Z，Yannas I V，etal.Fabricating Tubular Scaff olds with a Radial Pore Size Gradient by a Spinning Technique［J］.Bio materials，2006，27（6）：866－874.

［6］Yao D，Zhang W，Zhou J G.Controllable growth of gradient porous str uctures［J］.Bio macro molecules，2009，10（5）：1 282－1 286.

［7］Wu H，Wan Y，Cao X，etal.Fabrication of chitosan－g－polycaprolactone copoly mer scaff olds with gradient porous microstructures［J］.Materials Letters，2008，62（17－18）：2 733－2 736.

［8］龔興厚，鄧澤賢，張裕剛，等.一種制備聚合物三維多孔支架的方法：中國，CN101773682 A ［P］.2010－07－14.

［9］Gong X H，Wong C T，Lu W W，etal.Fabrication of poly（lactic acid）scaff olds by a modified solvent casting／porogen leaching method［J］.E－poly mers，2010（113）：110－115.

［10］Gong Xinghou，Tang Chak Yin，Zhang Yugang，etal.Fabrication of graded macroporous poly（lactic acid）scaff old by a pr ogressive solvent casting／porogen leaching approach［J／OL］.（2011－10－10）http：／／onlinelibrary.wiley.com／doi／10.1002／app.35690／abstract.

［11］L Wu，J Ding.In vitro degradation of three di mensional porous poly（D，L－lactide－co－glycolide）scaff olds for tissue engineering［J］.Bio materials，2004，25（27）：5 821－5 830.

［12］Lebourg M，Sabater Serra R，J Más Estellés，etal.Biodegradable polycaprolactone scaffold with controlled porosity obtained by modified particle－leaching technique［J］.J Mater Sci：Mater Med，2008，19（5）：2 047－2 053.