韋 韜, 顧文輝, 李 健, 張 波, 潘光華, 朱大玲, 王廣策

(1.天津科技大學 海洋科學與工程學院, 天津 300457; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3.中國科學院 研究生院, 北京 100049)

蝦青素(Astaxanthin)又名蝦黃質、龍蝦殼色素,化學名稱為 3,3’-二羥基-?,?’-胡蘿卜素-4,4’-二酮, 是一種分布廣泛的酮式類胡蘿卜素[1]。由于具有良好的著色功能和超強的抗氧化能力[2], 蝦青素已經(jīng)被廣泛應用于水產養(yǎng)殖[3]、醫(yī)療衛(wèi)生[4]、化妝品和保健品等行業(yè)[5-7]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種淡水單細胞綠藻, 是目前已知的蝦青素含量最高的生物物種[8-9], 最高含量達干質量的4%, 被認為是理想的天然蝦青素生產者[10-11]。紅球藻的生活史主要分游動細胞和不動細胞兩個階段: 環(huán)境適宜時,藻細胞快速生長, 為游動細胞; 當環(huán)境條件不利時,轉入不動細胞階段, 細胞內開始積累蝦青素[11]。根據(jù)培養(yǎng)過程中雨生紅球藻的形態(tài)和顏色變化, 可將藻細胞分為四類: 綠色游動細胞、綠色不動細胞、褐色不動細胞和紅色不動細胞[12]。

近年來, 國內外研究者對雨生紅球藻的培養(yǎng)條件及蝦青素合成的誘導條件進行了分析研究, 但由于不同研究者采用的培養(yǎng)方法和藻種的差異, 導致他們的實驗結果不盡相同[8,11,13]。在眾多的影響因子中, 碳源作為細胞內有機分子碳骨架的提供者, 對雨生紅球藻的生長及蝦青素的合成起著至關重要的作用。Kaplan等[14]指出二氧化碳是雨生紅球藻生長的最適碳源, 但過高濃度的二氧化碳又會造成培養(yǎng)液pH快速下降而不利于藻細胞生長。Kang等[15]的研究也顯示, 以二氧化碳為碳源進行光合自養(yǎng)時更有利于雨生紅球藻細胞中蝦青素的積累。雨生紅球藻是通過光合作用來固定二氧化碳, 然而, 目前關于二氧化碳濃度對雨生紅球藻光合能力影響的研究鮮有報道。此外, 氮也是雨生紅球藻生長過程中的必需元素, Harker[16]、Borowetzka 等[17]指出雨生紅球藻的最適氮源為硝酸鹽。雖然蝦青素分子中不含氮, 但培養(yǎng)液中氮濃度的高低對細胞的生長有明顯影響,進而會影響蝦青素的總量。同時, 接種時藻細胞的狀態(tài)對細胞內蝦青素的累積也有一定的影響, 而相關研究的報道則很少。

本實驗以二氧化碳為碳源, 研究了不同二氧化碳濃度對雨生紅球藻生長及蝦青素累積的影響, 同時, 對培養(yǎng)后紅球藻的光合能力進行了比較; 其次,在碳源較充足的條件下, 通過改變培養(yǎng)液中硝酸鉀濃度的濃度, 對培養(yǎng)體系中氮濃度的作用進行了系統(tǒng)的分析, 并對接種不同狀態(tài)的藻細胞的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialisFlotow N-212)由中國科學院海洋研究所提供, 本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)條件

按 MCM[17]的修正配方配制成基礎培養(yǎng)基, 滅菌(121℃、20 min)后添加適量維生素, 培養(yǎng)基初始pH為7.2。在光照培養(yǎng)箱中進行細胞的培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為22℃±1℃, 光暗周期: 12 h/12 h, 光照強度為70 μmol/(m2·s)。每天搖瓶數(shù)次, 防止細胞貼壁, 保種的藻細胞每7天轉接1次, 使其始終處于旺盛的對數(shù)生長時期。

1.3 實驗裝置

實驗裝置設計如圖 1所示。通過氣泵泵入滅菌的 CO2氣體, 其中高濃度 CO2(600 ×10-6)為除菌后的室內空氣, 低濃度CO2(60×10-6)是空氣經(jīng)由飽和氫氧化鈉溶液吸收處理后而得, CO2濃度通過CO2分析儀(Telaire 7001, USA)實時監(jiān)測, 并通過及時更換氫氧化鈉溶液進行控制, 以維持在 60×10-6左右,氣體流速為 30 L/(L·min)。

圖1 實驗裝置設計圖Fig. 1 Schematic diagram of experiment device

1.4 實驗設計

1.4.1 氣相二氧化碳濃度實驗

實驗中設兩個 CO2處理組, 分別為 600×10-6和60×10-6, 各處理組設 3個平行, 將處于對數(shù)生長期的雨生紅球藻細胞以3 500g離心5 min(22℃), 棄上清液后, 將收集的細胞用新鮮 MCM 培養(yǎng)基重新懸浮, 并接種于 5 000 mL三角瓶中, 接種后體積為3 000 mL。

1.4.2 硝酸鉀濃度實驗

綠色游動藻種: 連續(xù)通入較高濃度(600×10-6)的CO2氣體, 設置不同硝酸鉀濃度, 分別為: 0、1、10、100、200和300 mg/L, 每組設3個平行。接種前, 將處于對數(shù)生長期的雨生紅球藻藻液以3 500g離心 5 min(22℃), 棄上清液后, 將剩下的藻細胞用缺氮(不含硝酸鉀)的 MCM 培養(yǎng)液充分懸浮, 再以3 500g離心5 min(22℃), 然后將收集的細胞用含有不同硝酸鉀濃度的培養(yǎng)基重新懸浮, 最后接種于500 mL 三角瓶中, 接種后體積為350 mL。

綠色不動藻種: 雨生紅球藻細胞生長至穩(wěn)定期后, 由于營養(yǎng)消耗等原因, 藻細胞逐漸失去鞭毛, 轉為不動細胞。藻液經(jīng)充分靜置后, 去除懸浮液, 獲得綠色不動細胞作為綠色不動藻種。硝酸鉀濃度分別設置為0、10、100和300 mg/L, 培養(yǎng)條件及接種方法與綠色游動藻種實驗一致。

1.5 實驗參數(shù)測定

1.5.1 細胞密度

用血球計數(shù)板進行顯微細胞計數(shù)。將培養(yǎng)物充分搖勻后取5 mL至試管, 用4%的戊二醛固定藻樣后, 在雙筒顯微鏡下計數(shù)。細胞數(shù)目多時, 稀釋后計數(shù)。每個平行計數(shù)4次, 取平均值。

1.5.2 生長速率

根據(jù)普通生物學通用的計算公式[18]計算生長速率:

公式中:μ為相對生長速率;NT是時間T時的細胞密度;

N0是初始時的細胞密度;T為培養(yǎng)時間。

1.5.3 pH值

將培養(yǎng)液充分搖勻后取5 mL至試管, 用pH計測量。每個平行測量3次, 計算平均值。

1.5.4 光合參數(shù)

取70 mL藻液, 以3 500g離心5 min(22℃), 收集藻細胞, 利用Dual-PAM 100測得光合參數(shù)。

1.5.5 葉綠素含量

本實驗利用丙酮法提取總葉綠素[19], 計算公式為:

公式中:C(a+b)表示單位體積內的總葉綠素濃度, 單位為mg/L;

C(cell)表示單個細胞中的總葉綠素含量, 單位為pg/個;

A645和A663分別為645 nm和663 nm處, 1 cm提取液的吸光值。

1.5.6 蝦青素含量

參考Boussiba和Vonshak的方法[20]并加以改進,進行蝦青素的提取和測定。計算公式如下:

公式中:C1表示單位體積內的蝦青素濃度, 單位為g/L;

C2表示單個細胞中的蝦青素含量, 單位為 pg/個;

消光系數(shù)A1%,1cm=2220;

A492為492 nm處1 cm液層混合物的吸光值。

1.5.7 數(shù)據(jù)分析

用SAS 9.1軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用統(tǒng)計學方法處理所得數(shù)據(jù), 通過方差分析檢測各實驗組數(shù)據(jù)的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 二氧化碳對雨生紅球藻的影響

如圖2a 所示, 不同CO2濃度對雨生紅球藻生長的影響差異明顯: 當CO2濃度為600×10-6時, 細胞生長較快, 第20天時細胞密度達到42.67×104個/mL,前20 d的生長速率為0.11 d-1; 當CO2濃度為60 ×10-6時, 雨生紅球藻的最大細胞密度和相應的生長速率分別為 20.67×104個/mL 和 0.07 d-1, 均顯著低于利用高濃度CO2(600 ×10-6)培養(yǎng)后的值(P＜0.05)。

光合作用參數(shù):Y(II)表示任一光照狀態(tài)下 PSⅡ的實際量子產量, 即實際光合能力;Fv/Fm表示暗適應后 PSⅡ的最大光化學效率, 反映藻細胞潛在的光化學能力, 常作為光抑制的指標。30 d后, 高濃度CO2培養(yǎng)后的雨生紅球藻的Y(II)值為0.48,Fv/Fm為0.64(圖 2b), 低濃度 CO2培養(yǎng)后的Y(II)和Fv/Fm值分別為0.36和0.60, 二者之間差異明顯(P＜0.05)。

紅球藻經(jīng)高濃度CO2和低濃度CO2培養(yǎng)30 d后,在單位體積內所獲得的葉綠素濃度分別為(5.15±0.21)mg/L 和(4.86±0.48)mg/L, 無顯著性差異(P＞0.05); 單個細胞內高CO2組和低CO2組的葉綠素含量分別為(12.03±0.18)pg/個和(27.77±1.45)pg/個(P＜0.05)。

利用高濃度CO2培養(yǎng)雨生紅球藻30 d后, 獲得的蝦青素含量無論是單位體積內還是單個細胞中均高于低濃度 CO2培養(yǎng)組, 最大值分別為(1.85±0.11)mg/L 和(5.50±0.31)pg/個(圖 2d)。

2.2 硝酸鉀對雨生紅球藻的影響

綠色游動藻種:

在連續(xù)充氣(600×10-6CO2濃度)的條件下, 雨生紅球藻的生長隨著 KNO3濃度的變化而變化(圖3a)。當 KNO3濃度為 100、200和 300 mg/L時, 雨生紅球藻生長較好, 所獲得的最大細胞密度分別為 36.92×104、35.83×104和 40.17×104個/mL; 當培養(yǎng)液中初始 KNO3濃度逐漸降低后, 所得到的最大細胞密度也逐漸下降; 缺氮時, 細胞密度基本沒有增加。

當培養(yǎng)基中KNO3濃度較低時(0、1和10 mg/L),藻液的pH值在整個培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定, 保持在7左右; 當 KNO3濃度升高后, 藻液 pH 也隨之升高,當 KNO3濃度為 300 mg/L時, 第 8天時, 其值達到9.22(圖 3b)。

圖2 不同二氧化碳濃度對雨生紅球藻生長及蝦青素累積的影響Fig. 2 Effects of different CO2 concentrations on the growth and astaxanthin accumulation of H.pluvialis

雨生紅球藻綠色游動細胞培養(yǎng)12 d后, 無論是單個細胞還是單位體積內, 總葉綠素含量均隨著KNO3濃度的升高而升高(圖3c)。當KNO3濃度為300 mg/L時達到最大值, 分別為 38.13 pg/個和 15.67 mg/L 。

如圖3d所示, 雨生紅球藻在缺N的條件下也能積累一定量的蝦青素(6.69 pg/個); 當培養(yǎng)液中有 N時, 單個細胞內的蝦青素含量隨著 KNO3濃度的升高而降低, 并且在KNO3濃度為1 mg/L時獲得最大值(10.93 pg/個); 單位體積培養(yǎng)液內的蝦青素含量在KNO3濃度為100 mg/L時最大, 為2.86 mg/L。

綠色不動藻種:

當綠色不動細胞接種到新鮮培養(yǎng)基后, 無論KNO3濃度的高低, 藻密度在前兩天里只有較小的增長。兩天后, 當KNO3濃度相對充足時(100 mg/L和 300 mg/L), 藻細胞進入對數(shù)生長期, 生物量迅速增加, 獲得的最大細胞密度分別為 35.92×104個/mL和 39.33×104個/mL。與用游動細胞接種后相似, 在缺氮或KNO3濃度較低時, 細胞生長較慢(如圖 4a)。

雨生紅球藻不動細胞接種到缺氮或低 KNO3濃度的培養(yǎng)基后, 藻液 pH值始終保持較低水平。當KNO3濃度為100 mg/L和300 mg/L時, 最大pH值分別為8.04和8.87。

如圖4c, 不動細胞接種培養(yǎng)12 d后, 紅球藻中總葉綠素含量與培養(yǎng)基中的初始 KNO3濃度成正相關, 隨著KNO3濃度的升高而升高, 單個細胞和單位體積內的最大值分別為22.77 pg/個和8.96 mg/L。

當 KNO3濃度為 10 mg/L時, 不動細胞接種 12天后, 單個紅球藻細胞內蝦青素含量最大, 為 12.64 pg/個; 當KNO3濃度為300 mg/L時, 單位體積內的蝦青素含量最大, 為2.94 mg/L(圖4d)。

圖3 不同硝酸鉀濃度對雨生紅球藻綠色游動細胞生長及蝦青素累積的影響Fig. 3 Effects of different KNO3 concentrations on the growth and astaxanthin accumulation of H.pluvialis green vegetative cells

通過以上結果可以看出, 培養(yǎng)液中初始的KNO3濃度和接種細胞的類型對雨生紅球藻的生長及蝦青素的累積有很大的影響。當碳源和氮源相對充足時,紅球藻生長良好, 但較高的 KNO3濃度不利于藻細胞內蝦青素的積累; 當培養(yǎng)基中缺氮或氮源濃度較低時, 單個藻細胞內可以獲得較高的蝦青素含量,但此種狀態(tài)下的紅球藻生長緩慢, 細胞密度較低,導致單位體積培養(yǎng)液內的蝦青素總量偏低。

3 討論

作為光自養(yǎng)生物, 雨生紅球藻只有吸收了充足的CO2, 才能滿足光合作用的需求, 同時較高的CO2濃度有利于提高光合作用效率(圖2b)。然而, 培養(yǎng)液中自然溶解的 CO2濃度比較低, 不能滿足藻細胞迅速生長的要求, 需要不斷地補充。補充碳源的方法有很多, 如充CO2、添加NaHCO3和NaAc等。陸開形等[21]指出適于紅球藻生長的NaHCO3濃度為0.2 g/L,此時獲得的最大細胞密度為14.0×104個/mL。莊惠如等[22]分別選用乙酸鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖等為碳源, 研究了紅球藻混合營養(yǎng)及異養(yǎng)培養(yǎng)的條件,所得的最大細胞密度分別為 12.0×104個/mL和4.28×104個/mL。本實驗中充氣(CO2)條件下得到的最大藻細胞密度為 42.83×104個/mL, 遠遠高于上述研究者利用其他碳源培養(yǎng)時的值。

實驗證明雨生紅球藻的生長及蝦青素的累積受培養(yǎng)液中氮源濃度的影響: 在充入較高濃度 CO2的條件下, 當培養(yǎng)基中缺氮時, 紅球藻細胞內可積累一定量的蝦青素, 分析認為藻細胞中的Rubisco可作為一個氮庫, 為缺氮條件下細胞內蝦青素的積累提供了一定的氮源; 當培養(yǎng)基中KNO3濃度較低時, 雨生紅球藻生長緩慢, 單個細胞內的蝦青素含量較高,但因為細胞密度較低而使得蝦青素總量偏低; 當培養(yǎng)基中氮源濃度較高時, 雖然紅球藻生長良好, 但卻不利于細胞內蝦青素的累積。因此, 在利用雨生紅球藻進行蝦青素大規(guī)模生產時, 可在氮源較充足的培養(yǎng)液中連續(xù)充入一定濃度的 CO2氣體, 這不僅能為處于生長階段的雨生紅球藻提供充足的碳源, 而且隨著培養(yǎng)時間的延長、培養(yǎng)液中氮的消耗, 可誘使藻細胞內蝦青素的快速合成, 最終獲得較高的蝦青素產量。

圖4 不同硝酸鉀濃度對雨生紅球藻綠色不動細胞生長及蝦青素累積的影響Fig. 4 Effects of different KNO3 concentrations on the growth and astaxanthin accumulation of H.pluvialis green rest cells

4 結論

本實驗結果表明: 1)較高濃度的CO2氣體有利于雨生紅球藻光合作用的進行, 從而可促進藻細胞的快速生長; 2)在碳源較充足的條件下, 較低的氮濃度有利于誘導紅球藻細胞內蝦青素的累積, 且接種綠色不動藻種后能獲得更高的細胞內蝦青素含量。

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