韋 韜, 顧文輝, 李 健, 張 波, 潘光華, 朱大玲, 王廣策

(1.天津科技大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 天津 300457; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3.中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

蝦青素(Astaxanthin)又名蝦黃質(zhì)、龍蝦殼色素,化學(xué)名稱為 3,3’-二羥基-?,?’-胡蘿卜素-4,4’-二酮, 是一種分布廣泛的酮式類胡蘿卜素[1]。由于具有良好的著色功能和超強(qiáng)的抗氧化能力[2], 蝦青素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[3]、醫(yī)療衛(wèi)生[4]、化妝品和保健品等行業(yè)[5-7]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種淡水單細(xì)胞綠藻, 是目前已知的蝦青素含量最高的生物物種[8-9], 最高含量達(dá)干質(zhì)量的4%, 被認(rèn)為是理想的天然蝦青素生產(chǎn)者[10-11]。紅球藻的生活史主要分游動(dòng)細(xì)胞和不動(dòng)細(xì)胞兩個(gè)階段: 環(huán)境適宜時(shí),藻細(xì)胞快速生長(zhǎng), 為游動(dòng)細(xì)胞; 當(dāng)環(huán)境條件不利時(shí),轉(zhuǎn)入不動(dòng)細(xì)胞階段, 細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始積累蝦青素[11]。根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中雨生紅球藻的形態(tài)和顏色變化, 可將藻細(xì)胞分為四類: 綠色游動(dòng)細(xì)胞、綠色不動(dòng)細(xì)胞、褐色不動(dòng)細(xì)胞和紅色不動(dòng)細(xì)胞[12]。

近年來(lái), 國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)雨生紅球藻的培養(yǎng)條件及蝦青素合成的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了分析研究, 但由于不同研究者采用的培養(yǎng)方法和藻種的差異, 導(dǎo)致他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不盡相同[8,11,13]。在眾多的影響因子中, 碳源作為細(xì)胞內(nèi)有機(jī)分子碳骨架的提供者, 對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)及蝦青素的合成起著至關(guān)重要的作用。Kaplan等[14]指出二氧化碳是雨生紅球藻生長(zhǎng)的最適碳源, 但過(guò)高濃度的二氧化碳又會(huì)造成培養(yǎng)液pH快速下降而不利于藻細(xì)胞生長(zhǎng)。Kang等[15]的研究也顯示, 以二氧化碳為碳源進(jìn)行光合自養(yǎng)時(shí)更有利于雨生紅球藻細(xì)胞中蝦青素的積累。雨生紅球藻是通過(guò)光合作用來(lái)固定二氧化碳, 然而, 目前關(guān)于二氧化碳濃度對(duì)雨生紅球藻光合能力影響的研究鮮有報(bào)道。此外, 氮也是雨生紅球藻生長(zhǎng)過(guò)程中的必需元素, Harker[16]、Borowetzka 等[17]指出雨生紅球藻的最適氮源為硝酸鹽。雖然蝦青素分子中不含氮, 但培養(yǎng)液中氮濃度的高低對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯影響,進(jìn)而會(huì)影響蝦青素的總量。同時(shí), 接種時(shí)藻細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蝦青素的累積也有一定的影響, 而相關(guān)研究的報(bào)道則很少。

本實(shí)驗(yàn)以二氧化碳為碳源, 研究了不同二氧化碳濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)及蝦青素累積的影響, 同時(shí), 對(duì)培養(yǎng)后紅球藻的光合能力進(jìn)行了比較; 其次,在碳源較充足的條件下, 通過(guò)改變培養(yǎng)液中硝酸鉀濃度的濃度, 對(duì)培養(yǎng)體系中氮濃度的作用進(jìn)行了系統(tǒng)的分析, 并對(duì)接種不同狀態(tài)的藻細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialisFlotow N-212)由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供, 本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)條件

按 MCM[17]的修正配方配制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 滅菌(121℃、20 min)后添加適量維生素, 培養(yǎng)基初始pH為7.2。在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為22℃±1℃, 光暗周期: 12 h/12 h, 光照強(qiáng)度為70 μmol/(m2·s)。每天搖瓶數(shù)次, 防止細(xì)胞貼壁, 保種的藻細(xì)胞每7天轉(zhuǎn)接1次, 使其始終處于旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)如圖 1所示。通過(guò)氣泵泵入滅菌的 CO2氣體, 其中高濃度 CO2(600 ×10-6)為除菌后的室內(nèi)空氣, 低濃度CO2(60×10-6)是空氣經(jīng)由飽和氫氧化鈉溶液吸收處理后而得, CO2濃度通過(guò)CO2分析儀(Telaire 7001, USA)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè), 并通過(guò)及時(shí)更換氫氧化鈉溶液進(jìn)行控制, 以維持在 60×10-6左右,氣體流速為 30 L/(L·min)。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)圖Fig. 1 Schematic diagram of experiment device

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 氣相二氧化碳濃度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中設(shè)兩個(gè) CO2處理組, 分別為 600×10-6和60×10-6, 各處理組設(shè) 3個(gè)平行, 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻細(xì)胞以3 500g離心5 min(22℃), 棄上清液后, 將收集的細(xì)胞用新鮮 MCM 培養(yǎng)基重新懸浮, 并接種于 5 000 mL三角瓶中, 接種后體積為3 000 mL。

1.4.2 硝酸鉀濃度實(shí)驗(yàn)

綠色游動(dòng)藻種: 連續(xù)通入較高濃度(600×10-6)的CO2氣體, 設(shè)置不同硝酸鉀濃度, 分別為: 0、1、10、100、200和300 mg/L, 每組設(shè)3個(gè)平行。接種前, 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻藻液以3 500g離心 5 min(22℃), 棄上清液后, 將剩下的藻細(xì)胞用缺氮(不含硝酸鉀)的 MCM 培養(yǎng)液充分懸浮, 再以3 500g離心5 min(22℃), 然后將收集的細(xì)胞用含有不同硝酸鉀濃度的培養(yǎng)基重新懸浮, 最后接種于500 mL 三角瓶中, 接種后體積為350 mL。

綠色不動(dòng)藻種: 雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后, 由于營(yíng)養(yǎng)消耗等原因, 藻細(xì)胞逐漸失去鞭毛, 轉(zhuǎn)為不動(dòng)細(xì)胞。藻液經(jīng)充分靜置后, 去除懸浮液, 獲得綠色不動(dòng)細(xì)胞作為綠色不動(dòng)藻種。硝酸鉀濃度分別設(shè)置為0、10、100和300 mg/L, 培養(yǎng)條件及接種方法與綠色游動(dòng)藻種實(shí)驗(yàn)一致。

1.5 實(shí)驗(yàn)參數(shù)測(cè)定

1.5.1 細(xì)胞密度

用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行顯微細(xì)胞計(jì)數(shù)。將培養(yǎng)物充分搖勻后取5 mL至試管, 用4%的戊二醛固定藻樣后, 在雙筒顯微鏡下計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)目多時(shí), 稀釋后計(jì)數(shù)。每個(gè)平行計(jì)數(shù)4次, 取平均值。

1.5.2 生長(zhǎng)速率

根據(jù)普通生物學(xué)通用的計(jì)算公式[18]計(jì)算生長(zhǎng)速率:

公式中:μ為相對(duì)生長(zhǎng)速率;NT是時(shí)間T時(shí)的細(xì)胞密度;

N0是初始時(shí)的細(xì)胞密度;T為培養(yǎng)時(shí)間。

1.5.3 pH值

將培養(yǎng)液充分搖勻后取5 mL至試管, 用pH計(jì)測(cè)量。每個(gè)平行測(cè)量3次, 計(jì)算平均值。

1.5.4 光合參數(shù)

取70 mL藻液, 以3 500g離心5 min(22℃), 收集藻細(xì)胞, 利用Dual-PAM 100測(cè)得光合參數(shù)。

1.5.5 葉綠素含量

本實(shí)驗(yàn)利用丙酮法提取總?cè)~綠素[19], 計(jì)算公式為:

公式中:C(a+b)表示單位體積內(nèi)的總?cè)~綠素濃度, 單位為mg/L;

C(cell)表示單個(gè)細(xì)胞中的總?cè)~綠素含量, 單位為pg/個(gè);

A645和A663分別為645 nm和663 nm處, 1 cm提取液的吸光值。

1.5.6 蝦青素含量

參考Boussiba和Vonshak的方法[20]并加以改進(jìn),進(jìn)行蝦青素的提取和測(cè)定。計(jì)算公式如下:

公式中:C1表示單位體積內(nèi)的蝦青素濃度, 單位為g/L;

C2表示單個(gè)細(xì)胞中的蝦青素含量, 單位為 pg/個(gè);

消光系數(shù)A1%,1cm=2220;

A492為492 nm處1 cm液層混合物的吸光值。

1.5.7 數(shù)據(jù)分析

用SAS 9.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理所得數(shù)據(jù), 通過(guò)方差分析檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氧化碳對(duì)雨生紅球藻的影響

如圖2a 所示, 不同CO2濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響差異明顯: 當(dāng)CO2濃度為600×10-6時(shí), 細(xì)胞生長(zhǎng)較快, 第20天時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到42.67×104個(gè)/mL,前20 d的生長(zhǎng)速率為0.11 d-1; 當(dāng)CO2濃度為60 ×10-6時(shí), 雨生紅球藻的最大細(xì)胞密度和相應(yīng)的生長(zhǎng)速率分別為 20.67×104個(gè)/mL 和 0.07 d-1, 均顯著低于利用高濃度CO2(600 ×10-6)培養(yǎng)后的值(P＜0.05)。

光合作用參數(shù):Y(II)表示任一光照狀態(tài)下 PSⅡ的實(shí)際量子產(chǎn)量, 即實(shí)際光合能力;Fv/Fm表示暗適應(yīng)后 PSⅡ的最大光化學(xué)效率, 反映藻細(xì)胞潛在的光化學(xué)能力, 常作為光抑制的指標(biāo)。30 d后, 高濃度CO2培養(yǎng)后的雨生紅球藻的Y(II)值為0.48,Fv/Fm為0.64(圖 2b), 低濃度 CO2培養(yǎng)后的Y(II)和Fv/Fm值分別為0.36和0.60, 二者之間差異明顯(P＜0.05)。

紅球藻經(jīng)高濃度CO2和低濃度CO2培養(yǎng)30 d后,在單位體積內(nèi)所獲得的葉綠素濃度分別為(5.15±0.21)mg/L 和(4.86±0.48)mg/L, 無(wú)顯著性差異(P＞0.05); 單個(gè)細(xì)胞內(nèi)高CO2組和低CO2組的葉綠素含量分別為(12.03±0.18)pg/個(gè)和(27.77±1.45)pg/個(gè)(P＜0.05)。

利用高濃度CO2培養(yǎng)雨生紅球藻30 d后, 獲得的蝦青素含量無(wú)論是單位體積內(nèi)還是單個(gè)細(xì)胞中均高于低濃度 CO2培養(yǎng)組, 最大值分別為(1.85±0.11)mg/L 和(5.50±0.31)pg/個(gè)(圖 2d)。

2.2 硝酸鉀對(duì)雨生紅球藻的影響

綠色游動(dòng)藻種:

在連續(xù)充氣(600×10-6CO2濃度)的條件下, 雨生紅球藻的生長(zhǎng)隨著 KNO3濃度的變化而變化(圖3a)。當(dāng) KNO3濃度為 100、200和 300 mg/L時(shí), 雨生紅球藻生長(zhǎng)較好, 所獲得的最大細(xì)胞密度分別為 36.92×104、35.83×104和 40.17×104個(gè)/mL; 當(dāng)培養(yǎng)液中初始 KNO3濃度逐漸降低后, 所得到的最大細(xì)胞密度也逐漸下降; 缺氮時(shí), 細(xì)胞密度基本沒(méi)有增加。

當(dāng)培養(yǎng)基中KNO3濃度較低時(shí)(0、1和10 mg/L),藻液的pH值在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中保持穩(wěn)定, 保持在7左右; 當(dāng) KNO3濃度升高后, 藻液 pH 也隨之升高,當(dāng) KNO3濃度為 300 mg/L時(shí), 第 8天時(shí), 其值達(dá)到9.22(圖 3b)。

圖2 不同二氧化碳濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)及蝦青素累積的影響Fig. 2 Effects of different CO2 concentrations on the growth and astaxanthin accumulation of H.pluvialis

雨生紅球藻綠色游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)12 d后, 無(wú)論是單個(gè)細(xì)胞還是單位體積內(nèi), 總?cè)~綠素含量均隨著KNO3濃度的升高而升高(圖3c)。當(dāng)KNO3濃度為300 mg/L時(shí)達(dá)到最大值, 分別為 38.13 pg/個(gè)和 15.67 mg/L 。

如圖3d所示, 雨生紅球藻在缺N的條件下也能積累一定量的蝦青素(6.69 pg/個(gè)); 當(dāng)培養(yǎng)液中有 N時(shí), 單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量隨著 KNO3濃度的升高而降低, 并且在KNO3濃度為1 mg/L時(shí)獲得最大值(10.93 pg/個(gè)); 單位體積培養(yǎng)液內(nèi)的蝦青素含量在KNO3濃度為100 mg/L時(shí)最大, 為2.86 mg/L。

綠色不動(dòng)藻種:

當(dāng)綠色不動(dòng)細(xì)胞接種到新鮮培養(yǎng)基后, 無(wú)論KNO3濃度的高低, 藻密度在前兩天里只有較小的增長(zhǎng)。兩天后, 當(dāng)KNO3濃度相對(duì)充足時(shí)(100 mg/L和 300 mg/L), 藻細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 生物量迅速增加, 獲得的最大細(xì)胞密度分別為 35.92×104個(gè)/mL和 39.33×104個(gè)/mL。與用游動(dòng)細(xì)胞接種后相似, 在缺氮或KNO3濃度較低時(shí), 細(xì)胞生長(zhǎng)較慢(如圖 4a)。

雨生紅球藻不動(dòng)細(xì)胞接種到缺氮或低 KNO3濃度的培養(yǎng)基后, 藻液 pH值始終保持較低水平。當(dāng)KNO3濃度為100 mg/L和300 mg/L時(shí), 最大pH值分別為8.04和8.87。

如圖4c, 不動(dòng)細(xì)胞接種培養(yǎng)12 d后, 紅球藻中總?cè)~綠素含量與培養(yǎng)基中的初始 KNO3濃度成正相關(guān), 隨著KNO3濃度的升高而升高, 單個(gè)細(xì)胞和單位體積內(nèi)的最大值分別為22.77 pg/個(gè)和8.96 mg/L。

當(dāng) KNO3濃度為 10 mg/L時(shí), 不動(dòng)細(xì)胞接種 12天后, 單個(gè)紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量最大, 為 12.64 pg/個(gè); 當(dāng)KNO3濃度為300 mg/L時(shí), 單位體積內(nèi)的蝦青素含量最大, 為2.94 mg/L(圖4d)。

圖3 不同硝酸鉀濃度對(duì)雨生紅球藻綠色游動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)及蝦青素累積的影響Fig. 3 Effects of different KNO3 concentrations on the growth and astaxanthin accumulation of H.pluvialis green vegetative cells

通過(guò)以上結(jié)果可以看出, 培養(yǎng)液中初始的KNO3濃度和接種細(xì)胞的類型對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)及蝦青素的累積有很大的影響。當(dāng)碳源和氮源相對(duì)充足時(shí),紅球藻生長(zhǎng)良好, 但較高的 KNO3濃度不利于藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累; 當(dāng)培養(yǎng)基中缺氮或氮源濃度較低時(shí), 單個(gè)藻細(xì)胞內(nèi)可以獲得較高的蝦青素含量,但此種狀態(tài)下的紅球藻生長(zhǎng)緩慢, 細(xì)胞密度較低,導(dǎo)致單位體積培養(yǎng)液內(nèi)的蝦青素總量偏低。

3 討論

作為光自養(yǎng)生物, 雨生紅球藻只有吸收了充足的CO2, 才能滿足光合作用的需求, 同時(shí)較高的CO2濃度有利于提高光合作用效率(圖2b)。然而, 培養(yǎng)液中自然溶解的 CO2濃度比較低, 不能滿足藻細(xì)胞迅速生長(zhǎng)的要求, 需要不斷地補(bǔ)充。補(bǔ)充碳源的方法有很多, 如充CO2、添加NaHCO3和NaAc等。陸開(kāi)形等[21]指出適于紅球藻生長(zhǎng)的NaHCO3濃度為0.2 g/L,此時(shí)獲得的最大細(xì)胞密度為14.0×104個(gè)/mL。莊惠如等[22]分別選用乙酸鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖等為碳源, 研究了紅球藻混合營(yíng)養(yǎng)及異養(yǎng)培養(yǎng)的條件,所得的最大細(xì)胞密度分別為 12.0×104個(gè)/mL和4.28×104個(gè)/mL。本實(shí)驗(yàn)中充氣(CO2)條件下得到的最大藻細(xì)胞密度為 42.83×104個(gè)/mL, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上述研究者利用其他碳源培養(yǎng)時(shí)的值。

實(shí)驗(yàn)證明雨生紅球藻的生長(zhǎng)及蝦青素的累積受培養(yǎng)液中氮源濃度的影響: 在充入較高濃度 CO2的條件下, 當(dāng)培養(yǎng)基中缺氮時(shí), 紅球藻細(xì)胞內(nèi)可積累一定量的蝦青素, 分析認(rèn)為藻細(xì)胞中的Rubisco可作為一個(gè)氮庫(kù), 為缺氮條件下細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累提供了一定的氮源; 當(dāng)培養(yǎng)基中KNO3濃度較低時(shí), 雨生紅球藻生長(zhǎng)緩慢, 單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量較高,但因?yàn)榧?xì)胞密度較低而使得蝦青素總量偏低; 當(dāng)培養(yǎng)基中氮源濃度較高時(shí), 雖然紅球藻生長(zhǎng)良好, 但卻不利于細(xì)胞內(nèi)蝦青素的累積。因此, 在利用雨生紅球藻進(jìn)行蝦青素大規(guī)模生產(chǎn)時(shí), 可在氮源較充足的培養(yǎng)液中連續(xù)充入一定濃度的 CO2氣體, 這不僅能為處于生長(zhǎng)階段的雨生紅球藻提供充足的碳源, 而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、培養(yǎng)液中氮的消耗, 可誘使藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的快速合成, 最終獲得較高的蝦青素產(chǎn)量。

圖4 不同硝酸鉀濃度對(duì)雨生紅球藻綠色不動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)及蝦青素累積的影響Fig. 4 Effects of different KNO3 concentrations on the growth and astaxanthin accumulation of H.pluvialis green rest cells

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 1)較高濃度的CO2氣體有利于雨生紅球藻光合作用的進(jìn)行, 從而可促進(jìn)藻細(xì)胞的快速生長(zhǎng); 2)在碳源較充足的條件下, 較低的氮濃度有利于誘導(dǎo)紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的累積, 且接種綠色不動(dòng)藻種后能獲得更高的細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量。

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