劉 超，劉 洋，趙 頌，王翠瑤，肖建英

(遼寧醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,遼寧 錦州 121001)

蛋白激酶2(CK2)是一種生存性激酶，全酶以異構(gòu)四聚體形式存在，由2個(gè)催化亞基(ɑ或ɑ′)和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β)構(gòu)成，作為底物和與其相互作用蛋白的接頭蛋白發(fā)揮重要作用。CK2持續(xù)激活并普遍存在于腫瘤組織中，因此被認(rèn)為是藥物治療的潛在靶點(diǎn)[1]。有許多證據(jù)支持CK2的抗凋亡作用[2]，其作用機(jī)制是多方面的，因?yàn)镃K2有眾多底物。此外，CK2的許多靶蛋白參與細(xì)胞的生存和死亡，CK2和一些其他的生存途徑密切相關(guān)，尤其是與PI3K/PDK1/Akt途徑密不可分[3]。Akt，又叫蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、增生、生長(zhǎng)和代謝的重要蛋白激酶，是PI3K的重要下游分子，其活性依賴于PDK1 和mTORC2分別對(duì)Thr308 和Ser473的磷酸化，只有這2個(gè)關(guān)鍵性亞基聯(lián)合磷酸化才能使Akt完全激活[4-5]。高選擇性膜通透性CK2抑制劑四溴苯三唑(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole，TBB)的應(yīng)用為認(rèn)識(shí)CK2激酶的特殊細(xì)胞功能提供了一個(gè)很好的工具。但TBB抗腫瘤的具體機(jī)制尚不清楚，尤其TBB對(duì)甲狀腺癌的作用機(jī)制知之甚少。本研究旨在探討TBB對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞株增殖及CK2β與Akt表達(dá)的影響，進(jìn)而探討TBB的抗癌機(jī)制，為T(mén)BB的臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器TBB、L15培養(yǎng)液( Sigma公司)；RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0試劑盒 (Takara 公司)；CK2β(兔抗人多克隆抗體)、β-actin抗體(兔抗人多克隆抗體)(Santacruz公司)、Akt(兔抗人多克隆抗體)、Phospho-Akt (Ser473) 抗體、Phospho-Akt (Thr308) 抗體(Cell Signaling Technology)，Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Piece Biotechnology公司)；預(yù)染蛋白Marker(MBI公司)；CK2活性測(cè)定試劑盒(Upstate公司)；[γ-32P]購(gòu)自北京福瑞生物工程公司； BB16UV CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；Sunrise自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(Tecan公司)；PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf公司)；凝膠自動(dòng)成像儀GDS8000、電泳儀、電泳槽(Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組甲狀腺鱗癌細(xì)胞株SW579購(gòu)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所。培養(yǎng)基為L(zhǎng)15，含10%的胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1的鏈霉素，在飽和濕度、37℃、無(wú)CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶底面積80% 左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以1×105mL-1濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中或96孔培養(yǎng)板中。24 h后待細(xì)胞貼壁后給藥，TBB 組終濃度為25 μmol·L-1，Wortmannin組終濃度為100 nmol·L-1，設(shè)空白對(duì)照組及DMSO組，DMSO組加入5 μL DMSO [DMSO濃度小于0.1% (V /V)，此濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響]。

1.3 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞SW579，胰酶消化，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，以每孔1×105mL-1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后加入25 μmol·L-1TBB和100 nmol·L-1Wortmannin，每組6個(gè)復(fù)孔，DMSO組加入等體積DMSO，并設(shè)空白對(duì)照。作用24 h后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1) 20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，選擇570 nm波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度(A)值，并計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組×100%。

1.4 RT-PCR方法檢測(cè)CK2β和Akt的mRNA表達(dá)水平采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，于核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA含量，當(dāng)A260/A280比值達(dá)1.9～2.0時(shí)可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用TaKaRa RNA PCR(AMV)Ver3.0試劑盒，按操作步驟進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄條件42℃、30 min；99℃、5 min；5℃、5 min。PCR引物序列：CK2β，5′-AGCCGAGATGCTTTATGGA-3′,5′- GTGTCTTGATGACTTGGG-TG-3′，229 bp；Akt，5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′,5′- GCCAGGGACACCTCCATCT-C-3′,121 bp；β-actin,5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，5′-CTAGAAGC-ATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′，661 bp。循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃、30 s；CK2β基因52.6℃、Akt基因59.3℃、30 s；72℃、50 s；30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應(yīng)用EDAS290凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度測(cè)量，基因mRNA表達(dá)水平以每一樣品與其內(nèi)參β-actin灰度比值表示。

1.5 Western blotting方法檢測(cè)CK2β、Akt、Akt-pS473和Akt -pT308的蛋白表達(dá)收集對(duì)照組及處理組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。每瓶細(xì)胞加裂解液80 μL，冰上放置30 min，超聲破碎20 s/次，3～4次。12 000 r·min-1離心20 min取上清，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。取50 μg總蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含5%BSA的TBS(pH 7.4)將濾膜于室溫?fù)u動(dòng)2 h進(jìn)行封閉，封閉后的濾膜再分別與CK2β和Akt抗體(稀釋比為1∶500)、Akt-pS473、Akt-pT308(稀釋比為1∶ 200)、β-actin(稀釋比為1∶1 000) 4℃溫育過(guò)夜。經(jīng)TTBS洗滌后，HRP偶聯(lián)的IgG作為二抗(稀釋比為1∶5 000) 室溫溫育2 h，洗膜后，使用ECL發(fā)光法顯色。內(nèi)參采用β-actin。計(jì)算機(jī)軟件Image J處理，進(jìn)行密度分析，計(jì)算灰度值。

1.6 蛋白激酶CK2活性的測(cè)定收集加入上述處理的SW579細(xì)胞，用加蛋白酶體抑制劑cocktail的PBS沖洗，超聲裂解，12 000 r·min-1離心5 min，收集上清測(cè)蛋白濃度。每個(gè)反應(yīng)取等量的蛋白然后按照Casein Kinase 2 Assay Kit說(shuō)明書(shū)測(cè)定CK2的活性。加入10 μL的收集液(20 mmol·L-13-嗎啉基丙磺酸，pH 7.2；25 mmol·L-1甘油磷酸鹽；5 mmol·L-1乙二醇四乙酸酯；1 mmol·L-1正礬酸鈉,1 mmol·L-1二硫蘇糖醇)，加入 10 μL特異性多肽合成底物(RRRDDDSDDD) (終濃度200 μmol·L-1)。10 μL PKA抑制劑500 μmol·L-1ATP及100 mCi·L-1[γ-32P] ATP后開(kāi)始反應(yīng)。每1個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行管。樣品在30℃水浴反應(yīng)30 min，然后加入20 μL 40%三氯乙酸終止反應(yīng)。將樣品滴在Whatman P81 強(qiáng)陽(yáng)離子交換濾紙上，將濾紙放入0.75% 磷酸溶液中反復(fù)沖洗3 次以降低反應(yīng)背景。再將濾紙放入液閃瓶中，并加入10 mL蒸餾水，然后用 LS3801Beckman 液閃計(jì)數(shù)分析儀測(cè)定cpm值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率的變化TBB組細(xì)胞增殖抑制率(28.08%±9.743%)與Wortmannin組(24.54%±7.824%)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但藥物處理組與對(duì)照組(0%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，DMSO組(4.101%±2.408%)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 CK2β和Akt mRNA 表達(dá)水平PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳灰度測(cè)量分析表明：對(duì)照組CK2β和Akt表達(dá)量較高。與對(duì)照組比較，TBB組CK2β的mRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，Akt的mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化；Wortmannin組Akt的mRNA 表達(dá)水平顯著降低，CK2β的mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)表1和圖1。

表1 CK2β和Akt的mRNA表達(dá)水平

圖1 SW579細(xì)胞中 CK2β(A)和Akt(B)的mRNA表達(dá)水平電泳圖

2.3 蛋白激酶CK2的活性與對(duì)照組[(5 118.0±126.6) cpm]和DMSO組[(5 024.0±271.7) cpm]比較，TBB組CK2活性[(2 453.0±87.2) cpm]明顯降低(P<0.01)，而Wortmannin組內(nèi)源性CK2活性[(5 060.0±164.4) cpm]無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.4 CK2β、Akt、Akt -pS473和Akt-pT308的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，Wortmannin組內(nèi)源性CK2β的表達(dá)無(wú)明顯變化，TBB組CK2β的表達(dá)明顯降低。同時(shí)Akt Thr308和Ser473磷酸化狀態(tài)受到抑制，總Akt的水平未受處理因素的影響。見(jiàn)表2和圖2。

表2 SW579細(xì)胞中CK2β、Akt、Akt -pS473和Akt-pT308蛋白的表達(dá)水平

圖2 SW579細(xì)胞中CK2β、Akt、Akt-pS473和Akt-pT308蛋白表達(dá)的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在人群中的發(fā)病率為4%～7%。雖然近幾十年來(lái)傳統(tǒng)的治療方式如手術(shù)、 放療和化療等有了很大的改進(jìn)，但由此帶來(lái)的嚴(yán)重副作用使以上治療方式受到極大限制[6]，因此尋找一種潛在、穩(wěn)定、 選擇性的抗甲狀腺癌藥物成為當(dāng)前研究甲狀腺癌治療的熱點(diǎn)。探討CK2多功能性的研究受到限制，是由于其持續(xù)活性且抑制細(xì)胞內(nèi)其他激酶的活性等特點(diǎn)，應(yīng)用比較多的是激酶失活型的突變體和RNAi技術(shù)。這些技術(shù)由于細(xì)胞內(nèi)CK2蛋白有較長(zhǎng)半衰期，細(xì)胞內(nèi)定位和內(nèi)源性CK2的高表達(dá)而受到阻滯[7]。Wang等[7]和 Seeber等[8]報(bào)道:RNAi 和反義核酸有時(shí)是無(wú)效的，需要持續(xù)地處理細(xì)胞以達(dá)到有效敲除CK2的目的。這些局限性使藥理學(xué)方法成為最有潛力的工具去研究CK2細(xì)胞水平功能，并解釋開(kāi)發(fā)特殊的細(xì)胞通透性CK2抑制劑的必要性[8]。TBB為一種膜通透的高選擇性CK2抑制劑，已證明其在鑒定CK2作為細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)和揭示CK2在腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1,9]。目前TBB在甲狀腺癌中的作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Wortmannin對(duì)內(nèi)源性CK2的活性完全不起作用，TBB顯著地抑制CK2的活性和蛋白表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而CK2的mRNA水平也下降，說(shuō)明TBB對(duì)CK2在轉(zhuǎn)錄和翻譯及翻譯后修飾水平都可能存在調(diào)節(jié)作用。25 μmol·L-1TBB對(duì)Akt的mRNA和蛋白水平無(wú)影響，但下調(diào)CK2的表達(dá),Akt 的Thr308磷酸化狀態(tài)明顯降低，盡管其不是CK2的直接作用靶點(diǎn)[10]，這與本實(shí)驗(yàn)中TBB作用于SW579后引起Akt Thr308磷酸化狀態(tài)的抑制結(jié)果相一致。然而Ser473的磷酸化狀態(tài)是否受到影響與細(xì)胞內(nèi)CK2的活性狀態(tài)有關(guān)系，不同的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道[11-12]不盡相同，同時(shí)也與不同的細(xì)胞株和遺傳背景有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Akt活性的下降是由底物水平磷酸化降低引起的。CK2有助于保持Ser473和Thr308的磷酸化水平，是Akt活性調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。Di Maira等[10]報(bào)道:CK2可直接磷酸化Akt 129位Ser殘基，促使Akt進(jìn)一步激活。CK2是否通過(guò)磷酸化Akt 129位Ser殘基后進(jìn)一步磷酸化Ser473和Thr308，進(jìn)而維持Akt的活性狀態(tài)，以及TBB對(duì)甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞株的抑制作用是否通過(guò)調(diào)控 PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，還有待進(jìn)一步研究。

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