劉玉芹，陳翠珍，楊彩然，賈青輝，董淑珍，李 蓉，鄭新羽，房 海

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北秦皇島，066600)

抗菌藥物是目前防治仔豬大腸桿菌性腹瀉病的主要手段，因此出現(xiàn)了大腸桿菌耐藥譜不斷擴大，多重耐藥情況非常嚴重的現(xiàn)象。細菌通過質(zhì)粒的接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式獲得新的耐藥性是造成耐藥現(xiàn)象嚴重的一個重要原因［1］。大腸桿菌是可由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性的細菌之一，可攜帶含有多種耐藥表型的R質(zhì)粒，并進行橫向傳播，從而造成耐藥性的菌間傳遞，給疾病的防控帶來困難［2］。因此，對菌株的耐藥性及質(zhì)粒特征的研究有助于預(yù)防和控制細菌耐藥性的發(fā)生和蔓延。本試驗對分離自河北省5個不同市縣的12株豬源大腸桿菌進行了15種抗生素的耐藥性檢測，并提取質(zhì)粒，進行了耐藥譜和質(zhì)粒譜型的比較分析，探討大腸桿菌耐藥性與質(zhì)粒圖譜之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 試驗菌株及質(zhì)控菌株

2009年分離自河北省滄州、石家莊無極、石家莊正定、邯鄲、衡水等不同地區(qū)的已經(jīng)過系統(tǒng)鑒定、致病性檢驗和藥敏試驗的豬源大腸桿菌12株。質(zhì)控菌株:ATCC25922由河北科技師范學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。

1．2 培養(yǎng)基及藥品試劑

15種藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司;LB肉湯、MH肉湯、MH瓊脂和麥康凱瓊脂購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司;λDNA/HindⅢMarker、Goldview、瓊脂糖、Tris等購自東盛生物有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒購于康為世紀生物科技有限公司。

1．3 藥物敏感性測定

采用臨床實驗室標(biāo)準化協(xié)會(CLSI)推薦的瓊脂擴散法(K-B)測定38株大腸桿菌對15種常用抗菌類藥物的敏感性，并以大腸桿菌ATCC25922進行質(zhì)控。參照CLSI(2009)公布的標(biāo)準，以敏感、中介、耐藥等3種形式對抑菌圈作出判定，個別CLSI沒有列出。但我國人醫(yī)或獸醫(yī)仍使用的藥物按杭州天和微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準解釋。

1．4 質(zhì)粒的提取

按照質(zhì)粒小提試劑盒說明提取質(zhì)粒。以λDNA/HindⅢ為Marker，以TAE為緩沖液，采用110 V電壓，質(zhì)量濃度7 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀成像，對提取的質(zhì)粒進行鑒定。

1．5 質(zhì)粒DNA大小的測定

按 Hanse等［3，4］方法進行。以標(biāo)準 λDNA/HindⅢ酶切片段(其分子量分別為 23．10 ×103，9．40 ×103，6．60 ×103，4．40 ×103，2．30 ×103，2．00 ×103，0．60 ×103bp)的電泳結(jié)果為標(biāo)準系統(tǒng)，以遷移率為自變量，堿基數(shù)的對數(shù)為因變量建立回歸方程，換算出質(zhì)粒及酶切片段的堿基數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 大腸桿菌的耐藥性

分析12株豬源大腸桿菌對15種臨床常用藥物的藥敏試驗結(jié)果，分離菌株對氨芐西林的耐藥率達到了100%，對阿莫西林的耐藥率為91．7%，對四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率介于50%～70%。分離菌對阿米卡星、頭孢唑啉、鏈霉素和呋喃唑酮的敏感率為100%(表1)。

分析12株大腸桿菌的耐藥譜，分離到的豬源大腸桿菌存在多重耐藥性，12株菌對15種藥物中的一種或多種藥物耐藥，無一全部敏感(表2)。其中，最少的對2種藥物耐藥，最多的對7種藥物耐藥，以耐4種、6種和7種藥物為主，占總數(shù)的75%，這與一些抗菌藥物在生產(chǎn)中的長期使用有關(guān)。

2．2 大腸桿菌的質(zhì)粒圖譜

12株分離大腸桿菌用試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖1，表1)。耐藥菌株的質(zhì)粒攜帶率為100%，所有菌株均含有大小和數(shù)量不等的質(zhì)粒，最多4個，最少1個，質(zhì)粒大小在1．32×103～17．6×103bp之間。只攜帶了1個質(zhì)粒的菌株有2株，2個質(zhì)粒的有7株，3個質(zhì)粒的有2株，4個質(zhì)粒的有1株。

2．3 質(zhì)粒譜與耐藥譜關(guān)系分析

分析12株大腸桿菌的耐藥譜與質(zhì)粒譜的關(guān)系，可以發(fā)現(xiàn)，耐藥譜的寬窄與其所攜帶質(zhì)粒數(shù)的多少沒有明顯的正相關(guān)關(guān)系(表2)。耐藥譜窄的菌株，其所含質(zhì)粒數(shù)不一定少，如1號菌;耐藥譜寬的菌株，其所含質(zhì)粒數(shù)也不一定多，如6號菌。說明1個質(zhì)?？赡馨鄠€不同的耐藥基因，而同一個耐藥基因也可能存在于多個不同的質(zhì)粒中。質(zhì)粒譜相同的菌株其耐藥譜可以相同，也可以不同，如8號9號10號菌株。質(zhì)粒譜不同的菌株其耐藥譜也可以相同，如4號和5號菌株。同樣分析其他的菌株也可以出現(xiàn)類似的結(jié)果。

表1 12株豬源大腸桿菌的耐藥情況

圖1 大腸桿菌質(zhì)粒圖譜

表2 大腸桿菌的耐藥譜及質(zhì)粒譜

3 討 論

大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細菌，本次對8大類15種常用抗菌藥物對河北省不同地區(qū)發(fā)病豬場分離到的12株大腸桿菌耐藥性進行調(diào)查，結(jié)果表明，分離菌株全部為耐藥菌株，且對氨芐西林和阿莫西林均顯示極高的耐藥性(耐藥率高于90%)。養(yǎng)殖場用藥模式對場內(nèi)細菌耐藥性具有較大影響。近年來阿莫西林和氨芐西林在獸醫(yī)臨床的廣泛使用導(dǎo)致了耐藥菌株的大量出現(xiàn)，這些藥物的高耐藥率，已使他們失去了治療價值，建議停用。分離菌對阿米卡星、頭孢唑啉和鏈霉素等臨床投入使用不久或未大量使用的藥物敏感率達到了100%，這些藥物可供臨床選擇用藥參考。

對分離菌的耐藥譜做進一步分析發(fā)現(xiàn)，該菌存在廣泛的多重耐藥性，12株大腸桿菌分離株共有9種耐藥譜，耐藥譜有增寬的趨勢，且相同耐藥程度的分離株存在多個不同譜型，如4重耐藥菌株有3種譜型，耐藥譜完全相同的分離株最多2株，大多數(shù)分離株都具有不同的耐藥譜。這表明養(yǎng)殖場中用藥情況非常復(fù)雜。復(fù)雜的用藥情況是細菌產(chǎn)生多重耐藥性的一個重要原因。這也表明在養(yǎng)殖過程和臨床用藥中不要憑經(jīng)驗，最好對相應(yīng)病例分離株做藥物敏感性測定以保證治療的最佳效果。

質(zhì)粒圖譜分析技術(shù)是通過分析細菌所攜帶質(zhì)粒的數(shù)量、大小等特點進而對該病原菌進行追蹤、分型的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，可用于爆發(fā)流行菌株鑒定，其特異性和敏感性優(yōu)于血清學(xué)分型、藥物敏感性分型等依賴于細菌表型特征的分型方法［5］。由于細菌耐藥性的一部分是由質(zhì)粒決定的，因此質(zhì)粒指紋圖譜法也常用于分析耐藥菌株的內(nèi)在相關(guān)性［6］。

本試驗中通過對各菌株的耐藥譜和質(zhì)粒圖譜進行對比分析，發(fā)現(xiàn)細菌的耐藥譜與質(zhì)粒圖譜的條帶數(shù)并不成正相關(guān)關(guān)系，如6號菌，質(zhì)粒圖譜只有1個條帶，但耐藥譜卻高達6種藥物;有些菌株質(zhì)粒圖譜條帶數(shù)雖多，但其耐藥性卻不強，如1號菌質(zhì)粒圖譜有4個條帶，但耐藥譜卻僅有3種藥物。分析其原因可能是細菌的耐藥基因并不完全存在于質(zhì)粒上，或者細菌的1個質(zhì)粒就可能包含多個不同的耐藥基因，而使該細菌表現(xiàn)出對多種藥物的耐藥性。而同1個耐藥基因也可能存在于多個不同的質(zhì)粒中。本試驗的結(jié)果與王永芬等［7］、趙增成等［8］的研究結(jié)論一致，即細菌的質(zhì)粒攜帶與細菌的耐藥性之間并沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系。

4 結(jié) 論

分離自河北省5個不同市縣的12株豬源大腸桿菌全部為耐藥菌株，對氨芐西林和阿莫西林的耐藥率高于90%，對四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率介于50%～70%。分離菌株存在廣泛的多重耐藥性，以耐4種、6種和7種藥物為主，占總數(shù)的75%。對分離菌株耐藥譜與質(zhì)粒譜的分析表明，大腸桿菌的質(zhì)粒攜帶與細菌的耐藥性之間沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系。

［1］賴婧，劉洋，汪宇，等．800株不同動物源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測［J］．中國獸醫(yī)雜志，2011，47(4):12-14．

［2］房海，陳翠珍，張曉君．腸桿菌科病原細菌［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2011．

［3］HANSE J B，OLSEN R H．Isolation of large bacterial plasmids and characterization of the P2 incompatibility group plasmids PM G1 and PM G5 ［J］．J Bacteriol，1973(135):227-230．

［4］江文正，韓文瑜，王世若，等．豬致病性大腸桿菌的質(zhì)粒指紋圖譜分析［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報，1998，18(5):475-478．

［5］張玉霞，徐懷英．家禽大腸桿菌分型方法研究進展［J］．家禽生態(tài)學(xué)報，2011，32(5):98-100．

［6］張志堅，郭小兵，張欽憲．產(chǎn)ESBL大腸埃希氏菌質(zhì)粒譜與耐藥性分析［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報2008，29(21):1 970-1 972．

［7］王永芬，白靜，邊傳周．雞致病性大腸桿菌耐藥性與質(zhì)粒圖譜的分析研究［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007(1):71-72．

［8］趙增成，林樹乾，黃兵等．山東地區(qū)雞源型大腸桿菌的耐藥性與質(zhì)粒圖譜的監(jiān)測分析［J］．家禽科學(xué)，2009(10):42-44．