郭 陽，熊和平，陳 平，王延周，陳繼康，譚龍濤，鄭建樹，喻春明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

苧麻屬于蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria）宿根性草本植物，是一種多年生韌皮纖維植物。我國苧麻栽培歷史悠久，距今已有4 000余年。長江中下游地區(qū)的湖南、四川、江西、湖北等省是我國苧麻的主產(chǎn)區(qū)。由于各主產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境不同，通過長期的自然選擇和生產(chǎn)實(shí)踐，形成了種類繁多的地方品種，為苧麻育種奠定了基礎(chǔ)。許多學(xué)者根據(jù)經(jīng)濟(jì)性狀和形態(tài)學(xué)特征等對苧麻品種資源進(jìn)行了分類整理[1]。但傳統(tǒng)的利用系譜分析、地理來源及有限的表型鑒定數(shù)據(jù)，難以將大量的品種資源區(qū)別開來。

SSR分子標(biāo)記具有檢測手段簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，呈現(xiàn)共顯性遺傳，可以揭示完整遺傳信息等優(yōu)點(diǎn)，非常適合遺傳多樣性研究[2]，目前已應(yīng)用于水稻[3]、玉米[4]、棉花[5]、小麥[6]、豌豆[7]、蘋果[8]等多種作物的遺傳多樣性研究中。在苧麻研究中應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)，可以從DNA水平準(zhǔn)確區(qū)分不同的苧麻品種，減少人工調(diào)查的誤差，提高選擇效率[9-11]。隨著苧麻育種工作的開展，各地選育了較多的苧麻品種，但這些新品種間的遺傳關(guān)系還不清楚。該研究選擇來自湖南、江西、四川、湖北的9個(gè)主要苧麻品種和參加全國區(qū)試的新品系，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，分析這些品種的遺傳變異水平和相互間的親緣關(guān)系，以期為苧麻育種親本的合理選配提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試品種9個(gè)，分別為中苧1號(hào)、中苧2號(hào)、華苧4號(hào)、贛苧3號(hào)、川苧8號(hào)、中飼苧1號(hào)、圓葉青、74-69、D96-12，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所苧麻遺傳育種課題組收集保存（表 1）。

1.1.2 試 劑 植物基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、10×Taq reaction Buffer、2.5 mmol/L dNTP、50 bp DNA Marker購于天根生化科技有限公司；其他試劑均購于生工生物工程股份有限公司。試驗(yàn)所用的76對SSR引物[12]由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所多年生麻類種質(zhì)資源課題組提供，并從76對SSR引物中篩選出了29對條帶清晰、有多態(tài)性的SSR引物（表 2）。

表1 供試苧麻品種列表

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒提取9份苧麻種質(zhì)的基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳，利用BACKMAN DU800紫外分光光度計(jì)檢測DNA的純度和濃度。

1.2.2 SSR擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)體系：PCR采用20 μL反應(yīng)體系，其中 5 ng/μL 模板 2 μL，2.5 U/μL Taq酶 0.4 μL，10×Taq reaction Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.6 μL，0.2 μmol/L 的正向和反向引物各 1 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至 20 μL。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 35 s，50℃～60℃（依引物而定）退火 50 s，延伸 50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min，4℃保存。

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和張軍等[13]的銀染方法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 在銀染后的電泳圖上僅統(tǒng)計(jì)有差異、易于識(shí)別的多態(tài)性條帶。清晰且可重復(fù)的條帶記為“1”，同一位置上無條帶的記為“0”，建立“0”和“1”組成的原始矩陣，按照 Excel 5.0/95工作簿格式保存。利用NTsys 2.10e軟件中的SimQual程序計(jì)算遺傳相似系數(shù)。采用Clu-SHAN程序和UPGMA（非加權(quán)平均法）生成品種間親緣關(guān)系的聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性分析

選取檢測結(jié)果符合試驗(yàn)要求的9個(gè)苧麻品種的基因組DNA，從76對SSR引物中篩選出29對條帶清晰、有多態(tài)性的SSR引物對9個(gè)苧麻品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物B53和C14的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。29對SSR引物在9個(gè)苧麻品種中共檢測到152個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為127，占總擴(kuò)增位點(diǎn)的83.55%，表明9個(gè)苧麻品種具有較高的SSR多態(tài)性。每對引物檢測到2～11個(gè)位點(diǎn)，平均為4.38個(gè)，片段大小介于100～600 bp。Popgene分析顯示Nei基因多樣性為 0.337 1，Shannon信息指數(shù)為0.507 1，表明所選的9個(gè)苧麻主要品種的基因多樣度較低，雖然來自不同省份，但多樣性不夠豐富。

表2 SSR引物序列

圖1 引物B53和C14的SSR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 苧麻種質(zhì)的聚類分析

根據(jù)9個(gè)供試苧麻品種間SSR標(biāo)記揭示的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA方法進(jìn)行遺傳聚類分析，結(jié)果如圖2所示，9個(gè)苧麻種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.78，在遺傳相似系數(shù)為0.62處將全部材料分為A、B、C三類。A類包括中苧1號(hào)、中苧2號(hào)、川苧8號(hào)、贛苧3號(hào)、74-69、圓葉青、D96-12，這7個(gè)品種含有共同的原始親本黃殼早。中苧2號(hào)與川苧8號(hào)還具有相同的原始親本黑皮蔸，二者遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.70。中苧1號(hào)和D96-12都是以圓葉青為母本選育出來的優(yōu)良品種，二者遺傳相似系數(shù)最高，高達(dá)0.77。中飼苧1號(hào)和華苧4號(hào)各單獨(dú)歸為1類。

圖2 基于SSR標(biāo)記的9個(gè)苧麻品種的聚類圖

3 討論與結(jié)論

從76對SSR引物中篩選出29對多態(tài)引物對我國9個(gè)主要苧麻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究結(jié)果表明，共檢測到152個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為127個(gè)，占總擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的83.55%。每對引物檢測到2～11個(gè)位點(diǎn)，平均為4.38個(gè)，片段大小介于100～600 bp。Popgene分析表明Nei基因多樣性為0.337 1，Shannon信息指數(shù)為0.507 1。聚類分析結(jié)果表明9個(gè)苧麻品種的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.78。在遺傳相似系數(shù)為0.62處可將全部材料分為A、B、C三大類。

SSR分子標(biāo)記結(jié)果與系譜記載大體一致，可以將選育9個(gè)苧麻品種所用的原始親本間的交叉程度基本反映在聚類圖中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近上，但也存在一些例外。如圓葉青和74-69均為湘苧一號(hào)經(jīng)輻射育種選育出的優(yōu)良品種,但在聚類圖中遺傳相似系數(shù)僅為0.62。這個(gè)結(jié)果與羅素玉等[14]研究結(jié)果相同。而在形態(tài)學(xué)上，圓葉青成熟莖綠褐色，葉片圓形，深綠色，雌花黃白色，發(fā)蔸慢，分株力弱；74-69成熟莖黃褐色，葉片卵圓形，綠色，雌蕊微紅色，發(fā)蔸較快，分株力中等。這2個(gè)品種在分子水平和形態(tài)學(xué)上均顯示出較大的差異性。B類中的中飼苧1號(hào)葉片多、莖稈細(xì)、麻皮薄、葉莖比大；鈣、粗蛋白、粗纖維、粗灰分、粗脂肪、維生素B2、賴氨酸等營養(yǎng)品質(zhì)高；耐肥能力強(qiáng)、生物產(chǎn)量高、前期生長快、適合一年內(nèi)多次收割。中飼苧1號(hào)具有特有的適宜做飼料的形態(tài)性狀和產(chǎn)量性狀，這可能是基因重組或者發(fā)生了較大的變異等所致。C類華苧4號(hào)是從稀節(jié)巴品種自然雜交后代中選育出的優(yōu)良品種。稀節(jié)巴是湖南省的地方品種，在其他供試苧麻品種的原始親本中都未用到，因此與其他品種的交叉程度較小，單獨(dú)聚為一類。

該研究聚類分析結(jié)果與系譜來源有較好的一致性，但也在分子水平上說明了供試材料遺傳基礎(chǔ)較狹窄。所選用的苧麻品種數(shù)量較少，選育品種所用的親本間存在不同程度的交叉，因此苧麻品種省份間的差異不顯著，遺傳多樣性指數(shù)不高。在今后的工作中，育種工作者可以加大親本選擇范圍，利用不同省份間的優(yōu)良地方品種培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的苧麻新品種，豐富苧麻栽培品種的遺傳多樣性。

[1]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所.中國苧麻品種資源名錄 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1992.

[2]蔣彩虹,王元英,孫玉合.SSR和ISSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J].中國煙草科學(xué)，2007，28（2）：1-5.

[3]趙慶勇，張亞東，朱 鎮(zhèn)，等.30個(gè)粳稻品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2010，11（2）：218-223.

[4]李新海，傅駿驊，張世煌，等.利用SSR標(biāo)記研究玉米自交系的遺傳變異[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（2）：1-9.

[5]Chen G,Du X M.Genetic Diversity of Source Germplasm of Upland Cotton in China as Determined by SSR Marker Analysis[J].Acta Genetica Sinica,2006,33（8）:733-745.

[6]Wang H Y,Wang X E,Chen P D.Assessment of Genetic Diversity of Yunnan,Tibetan,and Xinjiang Wheat Using SSR Markers[J].Journal of Genetics and Genomics,2007,34（7）:623-633.

[7]宗緒曉，關(guān)建平，王述民，等.中國豌豆地方品種SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].作物學(xué)報(bào)，2008，34（8）：1330-1338.

[8]Zhang C Y,Chen X S,He T M,et al.Genetic Structure of Malus sieversii Population from Xinjiang,China,Revealed by SSR Markers[J].Journal of Genetics and Genomics,2007,34（10）:947-955.

[9]劉立軍，陳荷泉，蒙祖慶，等.44個(gè)苧麻栽培品種親緣關(guān)系的RAPD 分析[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（10）：107-112.

[10]周建林，揭雨成，蔣彥波，等.用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析苧麻品種的親緣關(guān)系[J].作物學(xué)報(bào)，2004，3（30）：289-292.

[11]鄒自征，陳建華，欒明寶，等.應(yīng)用RSAP、SRAP和SSR分析苧麻種質(zhì)親緣關(guān)系[J].作物學(xué)報(bào)，2012，38（5）：840-847.

[12]Chen J H,Luan M B,Song S F,et al.Isolation and characterization of EST-SSRs in the Ramie[J].African Journal of Microbiology Research.2011,21（5）:3504-3508.

[13]張 軍，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的PAGE/銀染快速檢測[J].棉花學(xué)報(bào)，2000，12（5）：267-269.

[14]羅素玉，唐守偉.苧麻核誘變育種技術(shù)及效果分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，1998，12（6）：337-341.