劉宏松 ，陳麗鵑 ，周冀衡

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.昆明市官渡區(qū)煙草公司，云南 昆明 650200）

煙草普通花葉病主要是由煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）引起的，煙草花葉病毒是披蓋病毒科煙草花葉病毒屬的單鏈RNA（ssRNA）病毒，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科和莧科等36個(gè)科350多種植物，有寄主范圍廣、抗逆性強(qiáng)、生產(chǎn)危害大等特點(diǎn)[1]。感染了煙草花葉病的煙葉，烤曬后色澤不均，品質(zhì)及等級(jí)均不同程度地下降[2]，是煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一[3-4]。由于植物沒(méi)有完整的免疫代謝系統(tǒng)，而煙草花葉病毒在植物細(xì)胞中屬于絕對(duì)寄生，其復(fù)制所需的能量、物質(zhì)和場(chǎng)所完全依賴于寄主，因此煙草花葉病毒病的防治較困難，對(duì)煙葉生產(chǎn)來(lái)說(shuō)是一種巨大的威脅。目前，煙草花葉病毒病已上升為威脅中國(guó)煙葉生產(chǎn)的主要病害之一，我國(guó)南北煙區(qū)常有加大規(guī)模的病情發(fā)生，尤其以南方煙區(qū)受害較重[5]。據(jù)報(bào)道，全世界每年僅由于TMV造成的經(jīng)濟(jì)損失就超過(guò)1億美元[6]。

當(dāng)前，煙葉生產(chǎn)中煙草花葉病最常用的防治方法有選擇抗病品種、培育無(wú)毒壯苗、施用抗病毒制劑、采用農(nóng)業(yè)保健栽培措施和生物防治等。然而，煙草品種具有較明顯的區(qū)域適應(yīng)性，同一品種在不同地區(qū)種植其抗病特性也有差異；同時(shí)，農(nóng)業(yè)栽培防治措施也僅僅起到有限的預(yù)防作用，其精細(xì)的栽培過(guò)程往往給煙農(nóng)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)；因此，尋求有效的煙草花葉病毒病防控措施已成為當(dāng)務(wù)之急。

植物資源廣泛，且植物是生物活性化合物的天然寶庫(kù)，植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過(guò)20萬(wàn)種，其中包含了大量的能有效控制植物病毒病的成分，而生物來(lái)源的抗病毒活性物質(zhì)既環(huán)保又無(wú)毒副作用，已逐漸成為抗病毒藥劑研發(fā)的新方向。筆者通過(guò)提取50種植物的生物活性物質(zhì)，來(lái)處理感染TMV病毒的煙株，以檢測(cè)其抑制TMV的生理效應(yīng)及防治效果，旨在為植物源抗病毒類生物農(nóng)藥的研制提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 共采集了云南（15種）、貴州（35種）兩省共50種植物（表1），經(jīng)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定并保存憑證標(biāo)本。

1.1.2 供試毒源 試驗(yàn)所用煙草花葉病毒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究所提供，試驗(yàn)前參照王人元的方法對(duì)病毒進(jìn)行純化，然后將純化后的病毒進(jìn)行紫外掃描，選擇呈典型的TMV核蛋白吸收曲（A260/A280=1.20）的病毒液進(jìn)行接種，接種液用PBS緩沖液定容為20 μg/mL。

1.1.3 供試烤煙品種 供試烤煙品種為心葉煙（Nicotiana glutinosa L.），將心葉煙種子與一定量基質(zhì)混勻后均勻?yàn)⒃谘b有基質(zhì)的育苗盤(pán)中，澆水適量，置于適宜條件下（溫度22℃，光照16 h/d，濕度60%）培養(yǎng)，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至4~6片真葉時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物材料的預(yù)處理 （1）將陰干的植物材料置于恒溫烘箱內(nèi)，加溫至50℃，干燥后粉碎，過(guò)40目篩，放入密封袋中備用。（2）將植物樣品用乙酸乙酯進(jìn)行超聲波提取，超聲波頻率為1 200 Hz，2s/次，工作間歇 0.2 s，全程 30 min，溫度 40℃。（3）植物樣品質(zhì)量與溶劑的體積比為1∶8，重復(fù)提取兩次，共計(jì)60 min。（4）將提取液過(guò)濾兩次，合并濾液進(jìn)行減壓濃縮。（5）用乙酸乙酯將濃縮液定容至20 mL刻度試管中，即1 mL提取物中含有1 g干植物樣品的物質(zhì)，密封后放到0~4℃冰箱中保存。（6）準(zhǔn)確吸取5 mL植物乙酸乙酯提取液（1 g/mL），以清水加乳化劑為基質(zhì)，稀釋為5倍液、10倍液、20倍液、50倍液，備用。

表1 供試植物名錄

1.2.2 防效測(cè)定 （1）TMV體外鈍化作用測(cè)定。以半葉枯斑法檢測(cè)植物提取液對(duì)TMV的體外鈍化作用。具體方法：選取健康生長(zhǎng)旺盛的4~6葉期心葉煙左半葉接種植物提取液（50倍液）與病毒的等體積混合液，右半葉接種蒸餾水與病毒的等體積混合液（對(duì)照），重復(fù)3次。接種5~7 d后計(jì)算枯斑數(shù)，枯斑抑制率計(jì)算公式：枯斑抑制率（%）＝（對(duì)照枯斑數(shù)－處理枯斑數(shù)）/對(duì)照枯斑數(shù)×100%。（2）對(duì)TMV初侵染和復(fù)制增殖作用的測(cè)定。同樣以半葉枯斑法進(jìn)行檢驗(yàn)。具體方法：選取健康生長(zhǎng)旺盛的4~6葉期心葉煙，初侵染試驗(yàn)中先在供試植物左半葉涂藥，間隔一定時(shí)間后，再全葉接種病毒；復(fù)制增殖試驗(yàn)中先全葉接種病毒，間隔一定時(shí)間后，再在供試植物的左半葉涂藥。植物提取液濃度為50倍液，嗎啉胍·乙銅濃度為400倍液，病毒接種濃度為10 μg/mL。各處理重復(fù)3次，5~7 d后計(jì)算枯斑數(shù)，按上述方法計(jì)算枯斑抑制率。（3）活性植物提取物質(zhì)之間增效作用的測(cè)定方法。采用協(xié)同毒力指數(shù)法確定兩種植物提取液混合使用時(shí)是否具備增效作用，計(jì)算公式為：混劑理論死亡率（%）=1－（1－Pa）×（1－Pb），式中Pa、Pb分別表示各單劑的枯斑抑制率；協(xié)同毒力指數(shù)（c.f）=（實(shí)際死亡率－理論死亡率）/理論死亡率×100。當(dāng)協(xié)同毒力指數(shù)＜-20時(shí)，表示兩種植物提取液表現(xiàn)為拮杭作用；當(dāng)協(xié)同毒力指數(shù)＞20時(shí)，表示兩種植物提取液表現(xiàn)為增效作用；當(dāng)協(xié)同毒力指數(shù)處于-20~20之間時(shí)，表示兩種植物提取液表現(xiàn)為相加作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物抗TMV的生物活性

采用50種植物提取物對(duì)TMV體外鈍化生物活性進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 五十種植物提取物對(duì)TMV體外鈍化生物活性測(cè)定結(jié)果

從表2中可以看出，在植物提取物干重濃度為0.1 g/mL的劑量下，50種植物提取物對(duì)TMV病毒病均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性。其中，乳漿大戟對(duì)TMV病毒病的抑制作用最強(qiáng)，枯斑抑制率高達(dá)65.66%；其次是甘草（62.12%）；蛇莓植物對(duì)TMV病毒病也表現(xiàn)出一定的抑制活性，枯斑抑制率達(dá)57.49%；其余47種供試植物樣品對(duì)TMV病毒病作用較弱，枯斑抑制率均＜50%。

2.2 植物提取物對(duì)心煙葉的初浸染和增殖侵染

在供試植物提取物的濃度下，選擇對(duì)TMV病毒病枯斑抑制率大于50%的3種植物進(jìn)行了活性復(fù)篩，主要研究其對(duì)TMV病毒病的初侵染和復(fù)制增殖情況，其結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可知，3種植物植物提取物對(duì)TMV病毒病的體外鈍化、初浸染、復(fù)制增殖都有明顯的抑制效果，且顯著高于對(duì)照藥劑。

2.3 植物提取物兩兩組合物對(duì)心煙葉的初浸染和增殖侵染

表3 甘草、乳漿大戟和蛇莓的植物提取物對(duì)TMV病毒病的初侵染和復(fù)制增值抑制活性 （%）

對(duì)2.2篩選出的甘草、乳漿大戟、蛇莓3種抗TMV活性物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配增效研究，結(jié)果（表4）表明：甘草＋蛇莓組合表現(xiàn)為增效作用；甘草＋乳漿大戟組合表現(xiàn)為相加作用；蛇莓+乳漿大戟組合表現(xiàn)為拮抗作用。

表4 不同植物提取物組合抗TMV的協(xié)同毒力指數(shù)

3 討論

植物作為可直接開(kāi)發(fā)利用的自然資源，目前正面臨著兩大危機(jī)：（1）野生植物資源的種類和產(chǎn)量呈逐年下降趨勢(shì)；（2）隨著藥用植物資源需求量的不斷增加，導(dǎo)致一些重要的藥用植物資源常年超量采挖。因此，植物天然活性物質(zhì)的生產(chǎn)和自然資源保護(hù)之間的矛盾日益突出。為了更好地開(kāi)發(fā)和利用這些具有較高農(nóng)用活性的植物，如何利用生物工程、基因工程等手段解決高農(nóng)用活性資源緊缺問(wèn)題的研究勢(shì)在必行。

該研究對(duì)50種植物提取物抗TMV活性的檢測(cè)不可避免的存在漏篩現(xiàn)象，即使在試驗(yàn)中對(duì)TMV無(wú)明顯抑制效果的植物，有可能因?yàn)樵囼?yàn)方法的缺陷或其他原因而沒(méi)有檢測(cè)出其真實(shí)活性，對(duì)于這些在初篩過(guò)程中很難避免的問(wèn)題，應(yīng)在以后的研究過(guò)程中高度重視。此外，關(guān)于該研究篩選出的“甘草＋蛇莓”組合的最佳增效比，以及各成分的增效機(jī)理仍有待深入研究。

[1]翟梅枝，高芳鑾，沈建國(guó)，等.抗TMV植物的篩選及提取條件對(duì)抗病毒物質(zhì)活性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，32（7）：45-49.

[2]朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國(guó)煙草病害[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.2002.

[3]賴榮泉，賴碧添，黃光偉，等.煙草病蟲(chóng)害預(yù)警防災(zāi)體系的構(gòu)建及其應(yīng)用[C].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007：808-810.

[4]上官克攀，林祥永，曾文龍，等.閩西煙區(qū)主要病害及其綜合防治技術(shù)體系[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2006，27（1）：20-23.

[5]吳艷兵，顏振敏，謝荔巖，等.天然抗煙草花葉病毒大分子物質(zhì)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（7）：1096-1101.

[6]吳云峰.生物病毒農(nóng)藥篩選及其應(yīng)用[J].世界農(nóng)業(yè)，1995，（5）：35-36.