吳開(kāi)云，程俊文，李紀(jì)元，范正琪，陳東亮

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽(yáng) 311400；2.浙江省林業(yè)科學(xué)院微生物研究所，浙江 杭州 311000）

微生物油脂（microbial oil）又稱單細(xì)胞油脂（single cell oil，SCO），是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭瑸樘荚?、氮源，輔以無(wú)機(jī)鹽生產(chǎn)出的油脂及另一些有商業(yè)價(jià)值脂質(zhì)[1]。微生物油脂可作為食用油脂的有效補(bǔ)充，尤其在生產(chǎn)功能性油脂方面有優(yōu)勢(shì)，還可代替植物用以制取生物柴油，緩解全球能源危機(jī)。因此，開(kāi)發(fā)微生物油脂這一新的油脂資源，具有深遠(yuǎn)意義。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，人類已獲得了很多具有高產(chǎn)油脂能力或富含稀有脂肪酸的產(chǎn)油微生物資源，并在提高微生物產(chǎn)油效率方面取得可喜的進(jìn)展。微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂具有油脂含量高、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，且可用細(xì)胞融合、細(xì)胞誘變等方法，使微生物產(chǎn)生富含某些特定脂肪酸（如EPA、DHA等）組分油脂[2-3]。

淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速及含油率高[4]等特點(diǎn)。深層發(fā)酵目前主要用于高附加值的醫(yī)藥、保健品工業(yè)發(fā)酵[5-6]，尚未見(jiàn)有關(guān)淺白隱球酵母產(chǎn)油脂深層發(fā)酵方面的研究。項(xiàng)目組在前期工作中，已經(jīng)對(duì)1株高產(chǎn)油脂的淺白隱球酵母菌種進(jìn)行了基因工程改造[7]，并在搖瓶發(fā)酵和實(shí)驗(yàn)室小型發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的優(yōu)化進(jìn)行了初步探索。在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了深層發(fā)酵中試，探索和優(yōu)化其在深層發(fā)酵試驗(yàn)中的各項(xiàng)條件參數(shù)，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 淺白隱球酵母菌種：基因工程改造菌株，中國(guó)林科院亞熱帶林業(yè)研究所提供，已轉(zhuǎn)入千年桐SAD外源基因[7]。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、蛋白胨、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸銨、亞硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、酵母膏、氯化鉀、硫酸鎂、無(wú)水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、硝酸銨及重鉻酸鉀等（國(guó)產(chǎn)化學(xué)純）；植物油、馬鈴薯、玉米粉等均為市售、食品級(jí)。

1.1.3 主要儀器 AIR-TECH超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；UV-9100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；DK-S22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；pHS-3C精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；XW-80A旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；YXQLS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SPX-150生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ZHWY-211B搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；Anke DL-4000B冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；10L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐（鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基 斜面保藏PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯塊 200，葡萄糖20，瓊脂15，加水至 1 L，121℃滅菌20 min。液體種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖25，（NH4）2SO43、KNO31、 酵 母 粉 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5。 搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 30，（NH4）2SO43、KNO31、酵母粉 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，28℃、pH值自然，140 r/min培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件研究 采用優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方在10 L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵工藝條件試驗(yàn)研究。考察不同的攪拌速率、通氣量、pH值控制方法等對(duì)淺白隱球酵母發(fā)酵生物量的影響，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。將搖瓶培養(yǎng)18 h的淺白隱球酵母液體菌種接入10 L發(fā)酵罐里，裝量7.5 L，接種量 10%（v/v），罐壓 0.03～0.05 MPa ，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度 250 r/min，通氣量初始為 1∶0.6，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后調(diào)為1∶0.8，初始pH值為6，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后調(diào)節(jié)恒定為4.0。每12h取樣一次，測(cè)定生物量進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 分析檢測(cè)項(xiàng)目及測(cè)定方法 （1）溶氧（DO）消耗：采用自動(dòng)罐的溶氧電極進(jìn)行測(cè)定，將培養(yǎng)基滅菌至保溫結(jié)束階段時(shí)溶氧定義為0，滅菌結(jié)束降溫至發(fā)酵溫度27℃，并向培養(yǎng)基中充分通氣和攪拌至培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧達(dá)到飽和，此時(shí)將溶氧電極讀數(shù)定位為100%。（2）pH值測(cè)定及其控制：采用發(fā)酵罐的pH電極進(jìn)行測(cè)定。采用濃度為1 mol/L的HCl及2 mol/L的NaOH，通過(guò)流加方式進(jìn)行pH值控制。

1.2.3 發(fā)酵生物量檢測(cè) 將發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶中的培養(yǎng)物在3 500 r/min下離心20 min，去除上清液，沉淀物用在60℃下烘至恒重，稱重。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 油脂檢測(cè) （1）油脂提?。豪盟釤岱ㄌ崛∮椭琜8]。發(fā)酵液于6 000 r/min離心5 min，菌體沉淀按每克菌6 mL的比例加入4 mol/L鹽酸，振蕩混勻，室溫放置30 min后，沸水浴5 min，-20℃速冷，加入2倍體積氯仿—甲醇（1∶1）提取液。充分振蕩后，6 000 r/min離心5 min，取氯仿層，加等體積1 g/L氯化鈉溶液，混勻，6 000 r/min離心5 min，取氯仿層，100 r/min 55℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去氯仿即得油脂。根據(jù)所得油脂質(zhì)量和發(fā)酵液體積計(jì)算油脂產(chǎn)量。（2）脂肪酸分析：采用氫氧化鉀—甲醇室溫酯化法，稱取油脂或脂肪酸50 mg置于10 mL量瓶?jī)?nèi)，加入2 mL石油醚和苯的混合溶劑（1∶1），輕輕搖動(dòng)使之溶解。再加入2 mL 0.4 mol/L氫氧化鉀—甲醇溶液，混勻[9]。在室溫下靜置5～10 min，加蒸餾水使全部有機(jī)相甲酯溶液升至瓶頸上部。靜置澄清后吸取上清液，所得清液即可用于氣相色譜分析。氣相色譜儀器檢測(cè)委托“國(guó)家林業(yè)局經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心”完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件研究

2.1.1 攪拌速率對(duì)淺白隱球酵母發(fā)酵的影響 微生物在發(fā)酵過(guò)程中，攪拌對(duì)于菌體生長(zhǎng)及其產(chǎn)物的生成非常重要，利用機(jī)械攪拌器的作用，使空氣和發(fā)酵液充分混合，提高發(fā)酵液的溶解氧，供給微生物生長(zhǎng)繁殖代謝過(guò)程所需的氧。攪拌速率大，則通氣及溶解氧情況好，傳質(zhì)快，有利于好氧菌的生長(zhǎng)，但是過(guò)高的攪拌速率會(huì)增大對(duì)菌絲體的剪切力，不利于酵母菌的增殖，對(duì)于產(chǎn)物的合成也會(huì)造成影響。而攪拌速率小，溶氧情況不好，傳質(zhì)差，不利于菌體生長(zhǎng)及其產(chǎn)物的形成。因此，合適的攪拌速率對(duì)于淺白隱球酵母的正常發(fā)酵很重要。從圖1中可知，發(fā)酵罐的攪拌速率對(duì)淺白隱球酵母生物量影響不大，當(dāng)攪拌速率為250 r/min時(shí)，淺白隱球酵母的干物質(zhì)生物量達(dá)到最大。因此，在淺白隱球酵母的發(fā)酵試驗(yàn)中，采用攪拌速率為250 r/min時(shí)較合適。

2.1.2 通氣量對(duì)淺白隱球酵母發(fā)酵的影響 通氣量是影響發(fā)酵的另一個(gè)重要因素，它對(duì)溶解氧狀況起決定性作用，通氣量與溶氧系數(shù)成正比，不同的生成時(shí)期對(duì)溶氧要求不同。對(duì)于好氧菌而言，溶氧主要用于菌體呼吸代謝及其產(chǎn)物的合成。在發(fā)酵過(guò)程中通氣量通常是以發(fā)酵液與通氣量體積之比來(lái)表示的，為了確定淺白隱球酵母在10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵的合適通氣量，采用了 1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8 、1∶1（V/V·min）幾個(gè)不同的通氣量進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果如圖 2 所示，當(dāng)通氣量超過(guò) 1∶0.6（V/V·min）后，生物量增加不顯著，綜合考慮，初始通氣量選為1∶0.6（V/V·min），后期適量增大較為合適。

2.1.3 pH值調(diào)控對(duì)淺白隱球酵母發(fā)酵的影響 如圖3所示，pH值對(duì)菌體的生產(chǎn)及代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有重要的調(diào)節(jié)作用，從試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始pH值為6時(shí)，發(fā)酵生物量達(dá)到最大，這可能是在

發(fā)酵初期pH值為6時(shí)更適合淺白隱球酵母生長(zhǎng)。

2.1.4 發(fā)酵罐工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 如圖4所示，淺白隱球酵母在上述發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件下，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，發(fā)酵生物量達(dá)到最大值，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌絲發(fā)生自溶，其值有所下降。即當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，生物量達(dá)最高，為4.63 g/L，此時(shí)發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化率為12.34%。圖5為發(fā)酵過(guò)程中期淺白隱球酵母菌絲顯微照片，顯示淺白隱球酵母在10 L液體發(fā)酵罐中菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

2.2 脂肪酸組分分析

在優(yōu)化條件下進(jìn)行深層發(fā)酵，收集提取的油樣進(jìn)行甲酯化處理，采用氣相色譜法測(cè)定淺白隱球酵母油脂樣品，結(jié)果如圖6所示，脂肪酸組分以油酸為主，其次是棕櫚酸，而硬脂酸含量較低。這可能是菌株含有轉(zhuǎn)入的千年桐SAD基因，表達(dá)了△9硬脂酰-ACP脫飽和酶，催化了硬脂酸在第9～10碳原子之間脫氫，促進(jìn)硬脂酸向油酸轉(zhuǎn)化的結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

在優(yōu)化淺白隱球酵母搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)10 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵工藝研究，其優(yōu)化發(fā)酵條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）配方為葡萄糖30，（NH4）2SO43，KNO31，酵母粉 2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5；裝液量 7.5 L、接種量 10%（v/v）、罐壓0.03～0.05 MPa、培養(yǎng)溫度28℃和攪拌速度250 r/min；通氣量初始為1∶0.6，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后調(diào)為1∶0.85；初始pH值為6，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后調(diào)節(jié)為4。攪拌速率為250 r/min時(shí)，剪切效應(yīng)和溶氧效益達(dá)到適度的平衡，淺白隱球酵母的生物量達(dá)到最大；通氣量達(dá)到 1∶0.6（V/V·min）時(shí)，生物量不再明顯增加；當(dāng)初始pH值為6時(shí)，生物量達(dá)到最大。此條件下培養(yǎng)60 h，發(fā)酵生物量最大，達(dá)4.63 g/L，此時(shí)發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化率為12.34%。

該試驗(yàn)是根據(jù)前期搖瓶試驗(yàn)的結(jié)果，選擇葡萄糖作為深層發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的主要碳源成分。鑒于在生產(chǎn)上大量使用葡萄糖存在成本高的問(wèn)題，可以用淀粉糖化代替，但需要通過(guò)試驗(yàn)確定適合的添加量和添加方法。該研究是在中試規(guī)模的發(fā)酵體積下進(jìn)行的，大規(guī)模容量的深層發(fā)酵試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究?？紤]到農(nóng)林副產(chǎn)品中有大量的木質(zhì)纖維素資源[10-11]，如何利用木質(zhì)纖維素作為淺白隱球酵母產(chǎn)油脂發(fā)酵的碳源，將具有重要的經(jīng)濟(jì)前景，并符合可持續(xù)發(fā)展的社會(huì)要求。

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