汪 洋，周 穎，田一星，王 智

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt），是一種能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）的細菌。在過去30多年中，Bt制劑廣泛成功地用于防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)、貯藏物害蟲和環(huán)衛(wèi)昆蟲等[1-3]。有研究表明，Bt蛋白對靶標生物和非靶標生物均存在富集，但是并未對靶標產(chǎn)生影響[4-6]。黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）是生物學研究中最重要的模式生物之一，廣泛應用于生物各個方面的研究[7]，Cry1Ab蛋白為Bt蛋白中的一種，目前尚未有與黑腹果蠅相關的Cry1Ab蛋白方面的報道。

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）對昆蟲分解外源毒物、維持正常生理代謝起重要作用[8]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是一種富含金屬離子的生物活性蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是不可缺少的氧自由基清除劑[9]。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），是體內(nèi)清除H2O2和許多有機過氧化物的重要酶，GSH-Px活性是衡量機體抗氧化力的重要指標[10]。

該研究采用Cry1Ab培養(yǎng)基飼養(yǎng)黑腹果蠅，研究了其對Cry1Ab的富集情況，以及在Bt蛋白脅迫下對黑腹果蠅體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽過氧化物酶的影響，以期揭示Bt蛋白對非靶標生物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 Cry1Ab蛋白購自上海佑隆生物科技有限公司，黑腹果蠅由湖南農(nóng)業(yè)大學遺傳學實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）正常培養(yǎng)基。A液：124 g白糖、12.4 g瓊脂，加水900 mL；B液：玉米粉165 g加水100 mL。將煮沸的A液加入B液中，混勻后加入10 mL丙酸，分裝到培養(yǎng)瓶中，待冷卻后撒少量酵母粉。（2）Cry1Ab培養(yǎng)基：正常培養(yǎng)基分裝前冷卻到50℃時，加入含Cry1Ab的蒸餾水，使培養(yǎng)基中Cry1Ab含量為200 ng/mL。

1.2 方法

1.2.1 種蠅培養(yǎng) 將黑腹野生型果蠅培養(yǎng)在干燥、25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，保持濕度50%～70%。

1.2.2 Cry1Ab蛋白在果蠅體內(nèi)的富集 取羽化8 h后的未交配的黑腹果蠅成蟲，在乙醚麻醉下分開雌雄并隨機挑選，并在正常培養(yǎng)基培養(yǎng)和Cry1Ab培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種后果蠅于恒溫箱中（25±1℃、濕度60%～70%）培養(yǎng)。培養(yǎng)5、10、15 d后，分別將在正常培養(yǎng)基（對照組）和Cry1Ab培養(yǎng)基（試驗組）上培養(yǎng)的果蠅用乙醚麻醉后備用，每個處理重復3次。

1.2.3 可溶性蛋白及Bt含量的測定 （1）可溶性蛋白測定：將果蠅在用冰浴中勻漿，在4℃、4 000 r/min下離心10 min，取上清液作為酶源。參照Bradford（1976）的方法[11]，用考馬斯亮藍 G-250 法測定各酶液中可溶性蛋白含量。（2）Bt含量的測定：采用上海佑隆生物科技有限公司的elisa試劑盒進行檢測。

1.2.4 酶活力的測定 （1）AChE活力測定：參照高希武（1987）方法[12]。0.1 mL的酶液加0.7 mL 0.067 mol/L的PBS緩沖液，再加0.1 mL 80 mol/L的ATCh，30℃下反應 30 min，然后加入 0.3 mL 10 mol/L的毒扁豆堿和1.8 mL 0.01 mol/L DTNB。磷酸鹽乙醇顯色劑終止反應，于412 nm處測定OD值。每個處理重復3次。（2）SOD活力測定：采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)T-SOD試劑盒進行檢測，每個處理重復3次。（3）GSH-Px活力測定：采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)T-SOD試劑盒進行檢測，每個處理重復3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理，并用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對果蠅體內(nèi)Cry1Ab蛋白富集量的影響

從表1可知，在Cry1Ab培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～10 d后，Cry1Ab蛋白在果蠅體內(nèi)均具有富集效應，且隨時間的增長而不斷增加；在第10天時達到最大富集量，約為對照組培養(yǎng)基中的3.7倍；培養(yǎng)10～15 d時，果蠅體內(nèi)的Cry1Ab蛋白含量下降，在第15天時，果蠅體內(nèi)的Cry1Ab蛋白含量已經(jīng)低于培養(yǎng)5 d時的果蠅體內(nèi)的Cry1Ab蛋白含量，接近正常值，說明果蠅體內(nèi)具有自我降解Cry1Ab蛋白的能力。

表1 不同培養(yǎng)時間果蠅體內(nèi)Cry1Ab蛋白含量

2.2 培養(yǎng)時間對果蠅體內(nèi) AchE、SOD、GSH-Px酶活力的影響

從表2中可看出，對照組果蠅培養(yǎng)0～15 d，體內(nèi)的AchE比較穩(wěn)定，在含Cry1Ab蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～15 d的果蠅AchE活力均低于對照組的果蠅，且存在極顯著性差異（P<0.01），表明Cry1Ab蛋白對果蠅產(chǎn)生了一定的毒害作用。Cry1Ab培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d時，AchE比活力最低，相當于對照的64%，此時Cry1Ab蛋白在果蠅體內(nèi)富集量亦最大，表明Cry1Ab蛋白能夠?qū)壍呐d奮性起到抑制作用。

在Cry1Ab培養(yǎng)基中培養(yǎng)的果蠅，在10～15 d內(nèi)SOD酶活力均低于對照組，且達到極顯著水平差異（P<0.01），表明Cry1Ab蛋白在果蠅體內(nèi)對果蠅的SOD酶產(chǎn)生了抑制作用。對照組果蠅在0～15 d內(nèi)SOD酶存在上升的趨勢，但是Cry1Ab蛋白培養(yǎng)基中的果蠅也在0～15 d內(nèi)SOD酶存在上升的趨勢。在第10天時，SOD酶活力和對照組差距最大，表明在第10天時Cry1Ab蛋白對SOD酶活力抑制性最強。對照組的果蠅GSH-Px在0～15 d內(nèi)基本穩(wěn)定。

表2 不同培養(yǎng)時間果蠅體內(nèi)3種酶的酶比活力

在含Cry1Ab蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的果蠅，GSH-Px活力在培養(yǎng)5、10、15 d時出現(xiàn)略微上升的趨勢，但總體酶活力均低于對照組，表明果蠅體內(nèi)的GSH-Px活力受到了一定的抑制。隨著培養(yǎng)時間的延長，GSH-Px活力略微增加，可能是體內(nèi)的一種自我保護機制所致。

3 討論

抗蟲轉(zhuǎn)基因作物對非靶標生物的影響一直是國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)安全性評價研究關注的焦點問題。該研究果蠅產(chǎn)生富集的結(jié)果與張志罡等[13]報道的Cry1Ab蛋白在稻縱卷葉螟中的富集的結(jié)果一致，也同陳茂等[14]研究的水稻-稻飛虱-擬水狼蛛食物鏈中非靶標生物擬水狼蛛存在富集的結(jié)果一致。研究中果蠅的Cry1Ab蛋白的富集存在最高富集量，與上述兩者的研究結(jié)果一致。這就意味著Bt蛋白無論對于靶標和非靶標生物均可產(chǎn)生影響。但在該研究中，果蠅體內(nèi)的3種保護酶的變化規(guī)律與張志罡報道的稻縱卷葉螟中相關酶類的變化規(guī)律不一致。這可能與張志罡等研究報道的稻縱卷葉螟是靶標生物，對Cry1Ab蛋白比較敏感，而果蠅是非靶標生物，其對Cry1Ab蛋白反應較靶標生物慢有關。一旦體內(nèi)出現(xiàn)Cry1Ab蛋白，靶標生物體內(nèi)的一些生物化學反應產(chǎn)生相應的解毒作用，解除對自身的毒殺作用。而果蠅雖然遭受到Cry1Ab蛋白的毒害作用后，體內(nèi)的3種解毒酶AchE、SOD、GSH-Px均不同程度受到了抑制。研究中該抑制在10 d時達到最大值，此時Cry1Ab蛋白的富集量也是達到最大值。此外，果蠅體內(nèi)的一些相關酶類需要一段時間來適應，從而發(fā)生相應的反應來消除這種蛋白的影響。培養(yǎng)之初，果蠅處于一種適應狀態(tài)，酶類因受到Cry1Ab蛋白的毒害均處于抑制狀態(tài)，但當抑制情況到達一定程度時，果蠅體內(nèi)自我保護機制可能發(fā)生作用，恢復了酶類的活性，不斷消除其對自身的影響，使得Cry1Ab蛋白含量出現(xiàn)了下降的趨勢，從而達到保護自己的目的。

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