黃 峰 韋艾凌

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)2010級博士研究生，湖南 長沙 410208)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一，應(yīng)用中醫(yī)藥治療主要以改善癥狀、提高生活質(zhì)量、增強(qiáng)放化療藥物的敏感性等達(dá)到減毒增效作用，有著確切的臨床療效，日益在癌癥的治療中顯示出重要價值，已成為綜合治療中不可缺少的手段之一。開展中醫(yī)藥治療PLC的實驗研究將有助于進(jìn)一步了解中醫(yī)藥治療的機(jī)制。癌痛消顆粒是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院韋艾凌教授在膈下逐瘀湯的基礎(chǔ)上加減而成的經(jīng)驗方劑，本實驗擬采用癌痛消顆粒干預(yù)治療移植性肝癌模型大鼠后，通過實時定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測微小核糖核酸(miRNAs)miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18 在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，以探討癌痛消顆粒治療PLC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠70只，清潔級，體質(zhì)量(200±20)g，取60只用于制作移植性肝癌大鼠模型，10只作為空白對照。斷奶Wistar雄性大鼠6只，清潔級，體質(zhì)量50～70 g，用于癌細(xì)胞增殖傳代，每周傳代1次，形成癌性腹水后制作瘤細(xì)胞懸液，以供移植性肝癌造模之用。所有動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院清潔級動物實驗室。實驗大鼠均購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK2009-0002。

1.1.2 實驗瘤株 Walker-256癌肉瘤，保存在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院-80℃冰箱的瘤株，原購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，為Walker-256腹水型Wistar大鼠，質(zhì)量約80 g。

1.1.3 藥品 癌痛消顆粒由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制備，主要藥物組成：白花蛇舌草、半枝蓮、赤芍藥、延胡索、香附、烏藥、黃芪、絞股藍(lán)、三棱、莪術(shù)、紅花、甘草，每克相當(dāng)于原藥材生藥4.86 g;氟尿嘧啶注射液(5-Fu，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020593)。

1.1.4 試劑 miRcute miRNA提取分離試劑盒、RNAstore樣品保存液均購自天根生化科技(北京)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、固相表面RNase清除劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，RPMI-1640、高糖DMEM(Gibco公司)，低熔點瓊脂糖(Sigma公司)。

反轉(zhuǎn)錄、定量PCR引物與探針：Rat-miR-199a-5p 5'-CCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC-3';Rat-miR-199a-3p 5'-ACAGTAGTCTGCACATTGGTTA-3';RatmiR-18 5'-TAAGGTGCATCTAGTGCAGATA-3由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.1.5 儀器設(shè)備 巴爾貝斯BBS-SDC凈化工作臺(濟(jì)南安賽醫(yī)療器械有限公司);Eppendorf5417R冷凍離心機(jī);SIM-F140AY65制冰機(jī);美國伯樂Gel Doc XR System全自動凝膠成像系統(tǒng);DNA Engine Opticon熒光定量PCR儀(MJ Research，Incorporated);BSC-1500IⅡB2-X 生物安全柜(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司);LT-1005臺式低溫恒溫槽(上海雙旭電子有限公司);K5500超微量分光光度儀(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立模型 將70只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組10只和造模組60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，空白對照組正常飼養(yǎng)，造模組采用肝內(nèi)直視下直接注射法造模。方法：斷奶Wistar雄性大鼠6只，分別腹腔注入Walker-256癌肉瘤和瘤鼠腹水，形成腹水后分別抽取癌性腹水5 mL，以1 200 r/min的速度離心2 min，摒棄上清液，用0.9%氯化鈉注射液洗滌再次離心1次，取稀糊狀濃縮的瘤細(xì)胞懸液備用。實驗用SD大鼠術(shù)前禁食8～12 h，2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰臥位，用橡皮筋固定四肢于實驗板上，自劍突下沿腹正中剪去體毛，用2%碘伏和75%酒精消毒后，沿腹白線逐層切開約1.5 cm，暴露大鼠腹腔，輕壓大鼠胸腔，托出肝左外葉，用1 mL注射器先抽取空氣0.1 mL，再抽取濃縮的瘤細(xì)胞懸液0.05 mL，針頭與肝臟表面呈30°角斜刺入鼠肝左外葉約0.5～0.8 cm，緩慢注入瘤細(xì)胞懸液 0.05 mL 后繼續(xù)推入空氣0.03 mL，快速拔針以防止瘤細(xì)胞懸液順針道逆流，穿刺點用棉簽壓迫3～5 min，觀察無活動性出血后輕送肝臟還納腹腔，關(guān)腹。術(shù)后前3 d按10萬單位/(只·d)肌肉注射注射用青霉素鈉，于造模第7 d隨機(jī)抽取7只(空白對照組2只，造模組5只)大鼠處死取肝臟，通過病理組織學(xué)檢查證實造模成功。

1.2.2 動物分組及給藥方法 將剩余55只造模組大鼠隨機(jī)分成癌痛消顆粒高、中、低劑量組及5-Fu對照組、蒸餾水對照組，每組11只，空白對照組大鼠8只。于造模后第8 d開始對癌痛消顆粒高、中、低劑量組予癌痛消顆粒溶液(藥物濃度為0.6 g/mL)按 2 mL、1 mL、0.5 mL 灌胃給藥，每日2次，連續(xù)治療14 d后停藥;5-Fu對照組采用5-Fu按75 mg/(kg·d)腹腔注射治療，每隔2 d 1次，共5次;蒸餾水對照組予蒸餾水每日2 mL灌胃，連續(xù)治療14 d。各組均停藥24 h后頸椎脫臼處死大鼠，嚴(yán)格消毒后開腹取出癌塊和癌旁組織，迅速以液氮冷凍，放入-80℃冰箱冷藏待檢?？瞻讓φ战M大鼠不進(jìn)行造模及施加處理因素，在相同的觀察時間內(nèi)進(jìn)行正常飼養(yǎng)，供實驗結(jié)束時作空白對照用。

1.3 肝癌及癌旁組織miRNAs表達(dá)的檢測

1.3.1 肝癌及癌旁組織總 RNA的提取 參照 miRcute miRNA提取分離試劑盒說明進(jìn)行操作，用miVanaTM miRNA Isolation Kit分離miRNA。將提取的RNA用1.2%瓊脂糖進(jìn)行電泳(圖1)，用K5500超微量分光光度儀檢測濃度及純度。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，應(yīng)用TRIzol一步法分別提取組織和細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.3.3 擴(kuò)增檢測 將miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增和檢測。采用SYBR Green Ι染料法進(jìn)行檢測，提取各樣本總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA以5次方等比稀釋上機(jī)摸索最佳模板濃度和擴(kuò)增效率。反應(yīng)條件為 94 ℃ -30 s，95 ℃ -10 s，58 ℃ -20 s，60 ℃ -20 s，plate read，40cycles，解鏈曲線60～95℃，由軟件自動生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線并設(shè)定基線。從熔解曲線可見反應(yīng)過程無引物二聚體和非特異擴(kuò)增(圖2)，保證數(shù)據(jù)的可靠性。本次試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

各組大鼠肝癌及癌旁組織miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達(dá)的測定CT值比較 見表1。

表1 各組大鼠肝癌及癌旁組織miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達(dá)的CT值比較 ±s

表1 各組大鼠肝癌及癌旁組織miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達(dá)的CT值比較 ±s

與空白對照組比較，* P＜0.05;與蒸餾水對照組比較，△ P＜0.05;與5-Fu對照組比較，#P＜0.05;與癌痛消顆粒高劑量組比較，＆P＜0.05

組 別 n miR-199a-3p miR-199a-5p miR-18肝癌組織 癌旁組織癌痛消顆粒高劑量組 11 13.37±1.57＊△# 5.72±0.61＊△# 4.54±0.86＊△# 2.02±1.92＊△# 0.72±0.20＊△# 0.48±0.55＊△#肝癌組織 癌旁組織 肝癌組織 癌旁組織癌痛消顆粒中劑量組 11 18.08 ±1.50＊△#＆ 7.71 ±1.85＊△#＆ 7.67 ±1.7＊△#＆ 3.05 ±0.59＊△#＆ 0.08 ±0.35＊△#＆ 0.39 ±0.72＊△#＆癌痛消顆粒低劑量組 11 2.37 ±0.71＊△ 1.80 ±0，.53＊△ 1.27 ±0.311＊△ 1.09 ±0.651＊△ 0.91 ±0.421＊△ 0.46 ±0.731＊△5-Fu 對照組 11 2.02 ±1.23＊△ 1.72 ±0.63＊△ 1.25 ±0.38＊△ 1.43 ±0.48＊△ 0.86 ±1.03＊△ 1.43 ±0.67＊△蒸餾水對照組 11 0.48 ±0.03* 0.45 ±1.60* 0.50 ±0.08* 0.60 ±0.18* 3.48 ±1.04* 1.70 ±0.16*空白對照組1 ±0.56 1 ±0.29 1 ±0.21 8

由表1可見，癌痛消顆粒高、中、低劑量組及5-Fu對照組、蒸餾水對照組 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達(dá)的CT值與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);癌痛消顆粒高、中、低劑量組及5-Fu對照組 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18 表達(dá)的 CT值與蒸餾水對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，癌痛消顆粒高、中劑量組與5-Fu對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，癌痛消顆粒低劑量組與5-Fu對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，癌痛消顆粒中劑量組與高劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

目前PLC全球發(fā)病率呈上升趨勢，我國年發(fā)病率約為34/10萬人，每年新發(fā)病患者超過10萬，每年約有23萬人死于肝癌，約占全世界肝癌死亡數(shù)的45% ～53%［1］。PLC給患者、家庭及社會造成了極大的影響和負(fù)擔(dān)，因此PLC的診斷、治療和預(yù)防就顯得尤為重要。

PLC的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜過程，通過尋找PLC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)基因，了解PLC的分子遺傳學(xué)機(jī)制為PLC的診斷、個體化治療提供理論基礎(chǔ)已成為目前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點。miRNAs是一類大約22 nt大小的保守非編碼小RNA，主要通過轉(zhuǎn)錄后對其靶基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控［2］，以mRNA為靶標(biāo)可在不同水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，據(jù)推測miRNAs能夠調(diào)節(jié)人類1/3的基因，參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學(xué)進(jìn)程［3］。

目前已發(fā)現(xiàn)若干miRNAs直接參與肝細(xì)胞癌變的發(fā)生和發(fā)展，肝癌組織中miR-18、pre-miR-18及miR-22較正常組織有更高水平的表達(dá)，miR-199a、miR-195、miR-199a、miR-200a及miR-125a表達(dá)水平則降低，依據(jù)這些差異表達(dá)的miRNAs來區(qū)分癌變組織與正常組織的精確度可達(dá)到97%［4］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PLC屬肝積等范疇，是由于多種原因?qū)е麦w內(nèi)毒聚、血瘀、正虛的改變，日久導(dǎo)致毒結(jié)不通，血瘀不行，氣機(jī)升降出入失常，阻于脅下，繼而發(fā)病［5］。根據(jù)PLC“毒、瘀、虛”的病機(jī)特點，解毒、化瘀、扶正是其基本治法。膈下逐瘀湯出自清·王清任《醫(yī)林改錯》，具有活血化瘀、行氣止痛、破癥消積之功，主治膈下瘀阻氣滯，形成痞塊等，韋艾凌教授正是根據(jù)自己多年臨床經(jīng)驗在原方基礎(chǔ)上加減而成癌痛消顆粒。方中以白花蛇舌草、半枝蓮為君，清熱解毒，散瘀止痛，直擊肝癌肇因;赤芍藥、延胡索、香附疏肝理氣，活血止痛，為臣藥;烏藥、黃芪、絞股藍(lán)、三棱、莪術(shù)清熱解毒，活血祛瘀，補(bǔ)脾益氣，養(yǎng)陰生精，散結(jié)止痛，為佐藥;紅花專入心、肝血分，活血通絡(luò)，甘草調(diào)和諸藥，共為使。諸藥合用，組方嚴(yán)謹(jǐn)，切合肝癌病機(jī)，可以攻補(bǔ)兼施、氣血同治、肝脾同調(diào)，具有祛邪不傷正、扶正不留邪的特點。

中藥一般是通過多種途徑、多個環(huán)節(jié)發(fā)揮抗癌作用，癌痛消顆粒為中藥復(fù)方制劑，藥味較多，成分復(fù)雜，有研究表明癌痛消顆?？上抡{(diào)大鼠移植性肝癌的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和微血管密度(MVD)表達(dá)，具有一定抑制Walker-256移植性肝癌血管生成的作用［6］，還可以下調(diào)肝癌細(xì)胞bcl-2基因蛋白的表達(dá)，具有誘導(dǎo)凋亡作用［7］。為進(jìn)一步探討癌痛消治療肝癌的機(jī)制，本實驗有針對性的引入觀察其對 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-18表達(dá)的影響。實驗研究結(jié)果表明，癌痛消顆粒各劑量組對肝癌及癌旁組織組織miRNAs的表達(dá)均具有調(diào)節(jié)作用，能夠降低miR-18的表達(dá)，升高miR-199a-3p、miR-199a-5p的表達(dá)，且以癌痛消顆粒中劑量組的療效最佳，其抗癌作用機(jī)制可能就與調(diào)節(jié)PLC的不正常miRNAs表達(dá)有關(guān)。

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