張夏蘭，楊 鑫，周英順，王紅寧*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；3.重慶市巴南區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 401320）

哺乳動(dòng)物白介素6是一種多功能細(xì)胞因子，又稱為B細(xì)胞分化因子、干擾素J32及肝細(xì)胞刺激因子。白介素6在哺乳動(dòng)物具有廣泛的生物學(xué)活性，幾乎能影響免疫系統(tǒng)的所有細(xì)胞，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、影響急性期的蛋白應(yīng)答和造血功能等方面發(fā)揮重要作用，并與其它細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)，共同構(gòu)成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。研究表明[1－4]，哺乳動(dòng)物和禽類的IL－6具有免疫佐劑效應(yīng)，能增強(qiáng)免疫應(yīng)答，同時(shí)還有資料顯示[5]，細(xì)胞因子基因真核表達(dá)質(zhì)粒能夠增強(qiáng)疫苗的免疫效果?；谝陨涎芯浚狙芯繕?gòu)建了中國白兔白介素6基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－IL－6，并與WHNRH株RHDV[6]核酸疫苗pcDNA－VP60、兔瘟組織滅活苗分別共同注射家兔后，觀察其對家兔免疫應(yīng)答的影響。

1 材 料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為20日齡、600～700 g的RHD非免疫中國白兔50只。質(zhì)粒pMD18－T－IL－6和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－VP60系本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。人“O”型紅細(xì)胞由成都市血站提供。溶菌酶、PEG8000，NH4Ac，異丙醇，NaOH，胰蛋白胨，酵母抽提物，小牛血清，葡萄糖，醋酸鈉，冰乙酸，氯仿，苯酚，無水乙醇均為分析純。

2 方 法

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－IL－6的構(gòu)建

將本實(shí)驗(yàn)室保存的pMD18－T－IL－6與pcDNA3.1（＋）真核表達(dá)載體質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后，進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR鑒定后，送大連寶生物公司測序。重組質(zhì)粒命名為 pcDNA－IL－6。

2.2 質(zhì)粒的大量提取及純化

質(zhì)粒DNA的大量提取，采取堿裂解法；純化則采取PEG（聚乙二醇）沉淀法。方法均參照分子克隆第三版進(jìn)行。

2.3 質(zhì)粒的脂質(zhì)體包被

在免疫動(dòng)物前，把脂質(zhì)體和質(zhì)粒按1∶1的比例混合，4℃靜置30 min即可使用。

2.4 動(dòng)物分組及免疫

首免前實(shí)驗(yàn)兔耳靜脈采血，分離血清，檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)兔出血癥病毒特異性抗體滴度，淘汰掉大于2 log2的兔子。將50只20日齡、600～700 g的家兔隨機(jī)分為5組，免疫兩次，兩次免疫時(shí)間間隔20 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫程序見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫程序

首免后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、70 d 對實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈采血，自動(dòng)凝集析出并收集血清，56 ℃30 min滅活，－20℃保存待檢。

2.5 特異性抗體的檢測及數(shù)據(jù)分析

兔瘟特異性抗體檢測采用血凝抑制（HI）試驗(yàn)進(jìn)行，檢測結(jié)果抗體效價(jià)用2n表示。應(yīng)用SPSS11.0對同一時(shí)間段不同組別、同一組別不同時(shí)間段得血清特異性抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2.6 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

用實(shí)驗(yàn)室保存地兔出血癥病毒分離株WHNRH，于免疫后70 d接種試驗(yàn)兔，每只皮下注射0.5 ml（100LD50）進(jìn)行攻毒，然后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)兔地發(fā)病及死亡情況，對死亡兔只做病理剖解。

3 結(jié) 果

3.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA－IL－6構(gòu)建結(jié)果

通過質(zhì)粒PCR、雙酶切和測序鑒定（見圖1），IL－6基因按照正確的閱讀框架插入到pCDNA3.1（＋）質(zhì)粒中，pcDNA－IL－6真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 兔IL－6 RT－PCR及質(zhì)粒p MD－IL－6鑒定結(jié)果

3.2 特異性抗體檢測結(jié)果

特異性抗體檢測結(jié)果，以血凝抑制抗體的最高倍比稀釋倍數(shù)2的次方值表示，（若血清抗體的最高血凝抑制效價(jià)是 “5”，則血清的稀釋滴度為1：25）。pcDNA－VP60真核表達(dá)質(zhì)粒，與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAIL－6免疫兔，以及pcDNA－IL－6與不同的疫苗免疫家兔之后，均產(chǎn)生了不同程度的RHDV特異性抗體，各實(shí)驗(yàn)組與空載體對照組相比，差異均極顯著（P＜0.01）。其中，核酸疫苗與pcDNAIL－6分子佐劑組合產(chǎn)生的抗體水平最高，單獨(dú)使用核酸疫苗效果最差，各組之間抗體水平在不同的時(shí)間段的差異不一致，從從差異不顯著到差異極顯著。特異性抗體在首免后抗體逐步上升，二免前兔瘟組織滅活苗上升相對核酸疫苗迅速，而核酸疫苗上升緩慢。二免后RHD核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答開始明顯上升。免疫后28 d抗各種疫苗誘導(dǎo)體達(dá)到峰值水平，免疫后70 d有的免疫組抗體明顯下降(表2)，免疫后血清抗體動(dòng)態(tài)變化曲線見圖2。

圖2 兔免疫后血清抗體動(dòng)態(tài)變化曲線

3.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

攻毒后第1 d，對照組就有實(shí)驗(yàn)兔死亡，第2 d未注射pcDNAIL-6真核質(zhì)粒組的實(shí)驗(yàn)兔開始死亡，第4d之后就沒有實(shí)驗(yàn)兔死亡。攻毒后死亡情況：對照組注射質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+),實(shí)驗(yàn)兔全部死亡，注射核酸疫苗pcDNA-VP60組，死亡3只，其他實(shí)驗(yàn)組無兔只死亡。對死亡兔進(jìn)行剖解，其病理變化表現(xiàn)為：氣管和支氣管黏膜充血；肝腫大，呈黃褐色，質(zhì)脆；脾臟腫大，呈黑紫色；腎呈暗紅色，被膜下和切面有大量出血點(diǎn)；肺表面有大小不等的出血斑，嚴(yán)重者甚至整頁肺出血；膀胱內(nèi)有黃褐色較濃稠的尿液；淋巴結(jié)腫大。

4 討 論

將細(xì)胞因子重組蛋白用于佐劑存在的主要缺陷是半衰期短，其活性易受內(nèi)環(huán)境如PH值、各種水解酶及血漿蛋白的影響；同時(shí)，大劑量的細(xì)胞因子還可導(dǎo)致發(fā)熱、炎癥等副作用。受DNA疫苗以質(zhì)粒作為抗原載體的啟發(fā)，以重組質(zhì)粒表達(dá)的細(xì)胞因子，即細(xì)胞因子基因佐劑，可以克服這些缺點(diǎn)而得以在DNA疫苗這個(gè)領(lǐng)域中得到更多的重視和研究。且基因佐劑1次少量接種即可在機(jī)體內(nèi)長時(shí)間低量表達(dá)，而且表達(dá)產(chǎn)物接近天然狗構(gòu)象，是體內(nèi)存在的免疫效應(yīng)因子，對機(jī)體無毒副作用。

許多細(xì)胞因子，已被證實(shí)能增強(qiáng)DNA免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，發(fā)揮佐劑的作用。郭焱等[1]報(bào)道，共表達(dá)IL-6基因質(zhì)粒能夠促進(jìn)小鼠免疫應(yīng)答；龍章富等[3]報(bào)道，豬IL-6基因能夠增強(qiáng)小鼠對豬帶絳蟲抗原基因的免疫應(yīng)答；嚴(yán)琳等[4]研究報(bào)導(dǎo)，豬IL-6基因的原核表達(dá)產(chǎn)物對偽狂犬病基因缺失疫苗具有免疫佐劑效應(yīng)。目前，有關(guān)中國白兔IL-6的免疫學(xué)特性研究，國內(nèi)還未見報(bào)道。了解中國白兔IL-6在家兔免疫應(yīng)答中的作用，具有重要意義，研究新型的分子免疫佐劑，提高疫苗免疫應(yīng)答能力，有重要實(shí)用價(jià)值。

本研究首次構(gòu)建了中國白兔IL-6真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAIL-6，并將其與兔瘟組織滅活苗和pcDNA-VP60 DNA疫苗聯(lián)合免疫試驗(yàn)兔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子佐劑pcDNAIL－6與疫苗聯(lián)合免疫時(shí)可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生快速持久的免疫應(yīng)答，證明了分子佐劑pcDNAIL－6對pcDNA－VP60 DNA疫苗和RHD組織滅活苗具有免疫佐劑效應(yīng)，能增強(qiáng)機(jī)體抵抗病毒的能力，這與其他關(guān)于哺乳動(dòng)物IL－6基因真核表達(dá)質(zhì)粒佐劑效應(yīng)研究結(jié)果基本吻合。同時(shí)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，從免疫后第14 d開始，共注射了pcDNAIL－6/脂質(zhì)體復(fù)合物的試驗(yàn)組抗體水平顯著高于未注射pcDNAIL－6/脂質(zhì)體復(fù)合物試驗(yàn)組，說明真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAIL－6在接種后14 d才表現(xiàn)出免疫增強(qiáng)作用，說明真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入機(jī)體后，需經(jīng)10～15 d方可得到良好的表達(dá)，與DNA疫苗進(jìn)入機(jī)體后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時(shí)間基本一致。

關(guān)于中國白兔IL－6分子佐劑效應(yīng)研究，國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究對中國白兔IL－6真核表達(dá)質(zhì)粒分子佐劑效應(yīng)的研究，為進(jìn)一步研究中國白兔IL－6的免疫學(xué)特性提供了基礎(chǔ)材料。

[1] 郭焱，金寧一，張應(yīng)玖，等.共表達(dá)HIV－1與IL－6核酸疫苗質(zhì)粒誘導(dǎo)小鼠免疫原性的研究[J].中華徽生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2002,22(2)：174.

[2] 郭斐，陸柔劍，孫朝暉，等.非復(fù)制重組痘苗病毒中白細(xì)胞介素6的表達(dá)及其對重組病毒免疫效果的形響[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2002,16(2)：136－141.

[3] 龍章富,高榮,孟民杰,等.脂質(zhì)體包裹豬白細(xì)胞介素6基因?qū)ωi帶絳蟲抗原基因免疫小鼠的影響[J].高技術(shù)通訊，2003,(3)：25－29.

[4] 嚴(yán)琳，何啟蓋，陳煥春,等.豬IL－2與IL－6的原核表達(dá)及其對偽狂犬病基因缺失疫苗的佐劑效應(yīng)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36（10)：1213－1218.

[5] 原冬偉，劉家森，郭東春，等.兔出血癥病毒VP60基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及初步評價(jià)[J].2011,31(11)：1582－1586.

[6] 李建文，王紅寧，田浪，等.兔出血癥病毒（RHDV）WHNRH株的分離鑒定及基因組全序列的測定與分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2006,46(5)：720－725.