楊鐵軍，何朝宏#，曹新廣，任君凱，陳小兵，王 躍

1)河南省腫瘤醫(yī)院;鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450008

2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植中心 鄭州 450052

腎移植手術(shù)過程中，冷灌注、冷保存及復(fù)流熱灌注等損傷因子對移植腎造成的冷缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury，IRI)無法避免，是影響移植腎功能恢復(fù)的重要因素。目前臨床已應(yīng)用一些防治IRI的藥物，但是效果均不十分理想，且昂貴。燈盞細辛又名燈盞花，屬菊科短亭飛蓬屬植物。已有文獻[1-2]證實其對腦、心等臟器的IRI具有保護作用。作者模擬臨床腎移植術(shù)中移植腎經(jīng)歷的IRI過程，建立大鼠冷IRI模型，觀察燈盞細辛對冷IRI導(dǎo)致的腎臟組織超微結(jié)構(gòu)、功能和生化指標的影響，為尋找防治冷IRI的有效藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 燈盞細辛注射液(云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司)，HC-A離體腎灌注液(上海長征醫(yī)院)冰凍備用，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性與丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)，日本日立公司日立H-7500透射電鏡，顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械廠)，10倍手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江光學(xué)儀器廠)，自制大鼠手術(shù)臺、腎臟冷保存袋等。

1.2 實驗動物來源、分組及處理方法 雄性成年SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g(河南省實驗動物中心提供)。術(shù)前24 h禁食，不禁水。實驗前采用隨機數(shù)字表將大鼠分為假手術(shù)組、模型對照組(給予冷IRI處理)和實驗組(給予冷IRI+燈盞細辛處理)3組(n=12)。3組均在術(shù)前經(jīng)鼠尾靜脈采血標本。實驗組術(shù)前15 min經(jīng)尾靜脈注射燈盞細辛注射液1.2 mL/100 g，假手術(shù)組與模型對照組按相應(yīng)劑量注射生理鹽水。假手術(shù)組處理方法:應(yīng)用20 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，正中切口打開腹腔，切除右腎并游離左腎蒂，60 min后關(guān)閉腹腔切口。模型對照組和實驗組建立冷缺血再灌注模型[3]:①首次冷灌注。切除右腎，10倍顯微鏡下在右腎動脈殘端插管，經(jīng)過腹主動脈至左腎動脈內(nèi)，原位灌注左腎HC-A離體腎灌注液8～10 mL(0～4℃)，左腎立即變蒼白，觸之冰涼，為灌注成功。通過右腎靜脈殘端插管直接將灌注液引流出體外，約2 min完成冷灌注后，用無損傷血管夾阻斷左腎蒂，結(jié)扎右腎蒂。②冷缺血保存:充分游離左腎，將其牽至腹腔外，向左側(cè)傾斜手術(shù)臺，在自制的保存袋中用冰水混合物浸泡左腎，實施冷保存。簡單縫合腹壁切口，盡量減少腹腔暴露對機體的影響。③再灌注:60 min后再次打開腹腔，去除腎臟冷保存袋，開放左腎動靜脈血管夾使左腎復(fù)灌，肉眼可見腎臟由蒼白色變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功。左腎復(fù)位，縫合切口。3組大鼠均在術(shù)后6 h開始給予100 g/L葡萄糖水喂養(yǎng)，自然光照，24 h后再次麻醉，原切口打開腹腔，下腔靜脈采血標本，立即摘取左腎。

1.3 觀察指標 采用透射電鏡觀察左腎超微結(jié)構(gòu)的變化;制作腎臟組織勻漿，檢測腎組織勻漿中SOD活性、MDA含量;手術(shù)前后取血標本，檢測血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0進行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組大鼠腎組織勻漿中SOD活性、MDA含量的差異，應(yīng)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠手術(shù)前后血漿BUN、Cr水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠左腎電鏡觀察結(jié)果 假手術(shù)組:近曲小管上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，微絨毛位置正常，排列整齊;細胞核結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)分布均勻;線粒體形態(tài)正常，呈長圓形或卵圓形，無腫脹，嵴清晰，基質(zhì)均勻豐富(圖1A)。模型對照組:近曲小管上皮細胞排列尚規(guī)律，較多微絨毛脫落至管腔中;胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡變性;線粒體腫脹明顯，形態(tài)失常，嵴結(jié)構(gòu)紊亂，部分線粒體膜破裂;細胞核結(jié)構(gòu)改變，可見染色質(zhì)邊集，電子密度增高，部分細胞核消失(圖1B)。實驗組:近曲小管上皮細胞排列規(guī)整，多數(shù)微絨毛在正常位置，有少部分微絨毛脫落至管腔中;線粒體輕度腫脹，其膜完整，部分嵴結(jié)構(gòu)紊亂;胞質(zhì)內(nèi)可見少量空泡樣變性，細胞器局部排列疏松，多數(shù)細胞核內(nèi)染色質(zhì)尚均勻(圖1C)。

圖1 3組大鼠左腎近曲小管上皮細胞的電鏡結(jié)果(×5000)

2.2 3組大鼠腎組織勻漿中SOD活性與MDA水平比較 見表1。

表1 3組大鼠腎組織勻漿中SOD活性與MDA水平比較

2.3 3組大鼠手術(shù)前、后血漿BUN、Cr水平比較見表2。

表2 3組大鼠手術(shù)前、后血漿BUN、Cr水平比較(n=12)

3 討論

腎移植是治療終末期腎病的有效治療方法，隨著精確的基因配型與強效免疫抑制藥物的應(yīng)用，排斥反應(yīng)對移植物的威脅不斷減少。而缺血再灌注在腎移植過程中不可避免。文獻[4]報道IRI觸發(fā)受體固有免疫，與移植物長期生存有關(guān)[5]，因此器官移植領(lǐng)域愈加重視IRI對移植物存活的影響，一直在致力尋找防治IRI的有效藥物。燈盞細辛主要分布在我國云南地區(qū)，文獻[6]報道燈盞細辛中含有豐富的咖啡酸乙酯等黃酮類物質(zhì)，具體成分尚未完全查明，具有抗血栓、抑制凝血、促進纖溶活性及改善血液的高凝狀態(tài)和微循環(huán)等作用。

作者應(yīng)用大鼠腎冷缺血再灌注觀察燈盞細辛對腎臟IRI的保護作用。腎組織勻漿生化結(jié)果顯示:實驗組中SOD活性高于模型對照組，MDA含量低于模型對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化物，測試MDA的含量常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映細胞損傷的程度。腎臟缺血再灌注前應(yīng)用燈盞細辛可以明顯提高SOD的活性，提高機體清除氧自由基的能力，且MDA含量降低，提示氧化損傷減輕。血生化結(jié)果顯示:實驗組缺血再灌注后24 h的BUN、Cr低于模型對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，證實應(yīng)用燈盞細辛后冷缺血再灌注對腎臟功能的損害減輕。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腎臟正常，模型對照組腎臟組織中的線粒體等細胞器形態(tài)失常，胞質(zhì)內(nèi)空泡樣改變。實驗組較模型對照組損傷明顯減輕，2組在腎曲小管的差異最大(該部位是產(chǎn)生氧自由基最多的地方)。氧化損傷是IRI中最重要的途徑，在超微結(jié)構(gòu)中線粒體的損傷最明顯，該研究中線粒體形態(tài)學(xué)變化符合IRI過程中該細胞器的功能變化。

有研究報道三七總苷[7]、苦菜總黃酮[8]對腎、心等器官IRI的保護作用也是通過其抗氧化作用實現(xiàn)的。該研究結(jié)果表明燈盞細辛能夠減輕大鼠腎臟冷IRI中的氧化損傷，證實該藥物對靶器官腎臟亦具有保護作用。作者將進一步研究該藥物對IRI過程中腎小管上皮細胞的信號傳導(dǎo)與細胞凋亡等分子生物學(xué)機制的影響。

[1]楊淑艷，鐘秀宏，鄭中華，等.燈盞花素對腦缺血再灌注損傷的細胞和分子保護機制研究現(xiàn)狀[J].中國藥房，2009，20(9):714

[2]王利果，李樹青.燈盞細辛對大鼠心肌缺血再灌注心律失常和細胞凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7(1):52

[3]楊鐵軍，謝小娟，陳小兵，等.大鼠腎冷缺血再灌注損傷模型的建立[J].中華實驗外科雜志，2011，28(6):998

[4]McKay DB.The role of innate immunity in donor organ procurement[J].Semin Immunopathol，2011，33(2):169

[5]Timsit MO，Yuan X，F(xiàn)loerchinger B，et al.Consequences of transplant quality on chronic allograft nephropathy[J].Kidney Int Suppl，2010，119:S54

[6]谷黨英.燈盞細辛的研究進展及臨床應(yīng)用[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報，2009，24(2):48

[7]張可，李華，王軍.三七總苷對大鼠缺血再灌注腎損傷的保護作用[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2006，41(6):1165

[8]劉仰斌，李啟華，劉欣.苦菜總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，45(1):107