張嬌嬌， 江 力， 楊 杰， 慈凌坤， 盧云峰， 曹樹(shù)青

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 合肥 230061）

干旱是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要環(huán)境因子之一。全球約有43%的耕地為干旱、半干旱地區(qū)，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，造成樹(shù)木和農(nóng)作物嚴(yán)重減產(chǎn)。干旱已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量的逆境脅迫之一［1－2］，對(duì)抗旱作物的育種及抗旱機(jī)理的研究具有深遠(yuǎn)重大的意義。

擬南芥是分子生物學(xué)研究的模式植物，它的完整基因組已被成功測(cè)定，為研究新基因、基因功能方面提供很多依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用甘露醇模擬干旱脅迫篩選擬南芥抗旱突變體，并通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)及生理生化指標(biāo)的測(cè)定來(lái)鑒定抗旱突變體。該研究不僅為抗旱基因克隆及功能分析奠定基礎(chǔ)，對(duì)于進(jìn)一步探索水分脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其應(yīng)答干旱脅迫分子機(jī)制也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用擬南芥（Arabidopsis）生態(tài)型為Columbia，野生型（WT）和突變體（Mutant）來(lái)自美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心［3］，實(shí)驗(yàn)采用2種方法培養(yǎng)植株［4－5］：

（1）培養(yǎng)基培養(yǎng)。種子經(jīng)0.1%HgCl2消毒3min后，用無(wú)菌水沖洗4～5次，然后將種子點(diǎn)種在加入1.5% 蔗糖和0.8% 瓊脂的培養(yǎng)基中；并用封口膜封裝，于4℃條件下處理2d后轉(zhuǎn)至光周期16h光／8h暗、光照100μmol／（m2·s2）、溫度22～23℃的培養(yǎng)室。

（2）土壤培養(yǎng)。① 幼苗移至裝有混合好的滅菌營(yíng)養(yǎng)土的盆缽中，置于光周期16h光／8h暗、光照100μmol／（m2·s2）、溫度22～23℃的培養(yǎng)室內(nèi)，移栽和開(kāi)花時(shí)各澆1次營(yíng)養(yǎng)液，并根據(jù)植株生長(zhǎng)需要澆以適量水；② 種子播種于裝有滅菌土的盆缽中，澆含有不同濃度甘露醇的營(yíng)養(yǎng)液，置于光周期16h光／8h暗、光照100μmol／（m2·s2）、溫度22～23℃的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 篩選

1.2.1 確定抗旱突變體的篩選濃度

將野生型擬南芥種子分別點(diǎn)在甘露醇濃度為250、300、350、400mmol／L的 MS培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿中播種50粒種子，成5×10矩陣，水平放置培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)4℃冰箱黑暗2d春化、光照培養(yǎng)7～10d后，記錄發(fā)芽率。以野生型幾乎不能發(fā)芽或者發(fā)芽不能存活的甘露醇濃度為臨界篩選濃度。

1.2.2 擬南芥抗旱突變體的篩選

以確定的篩選濃度配制培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。培養(yǎng)皿中央點(diǎn)野生型種子作為對(duì)照，其余部分點(diǎn)突變體種子，水平放置培養(yǎng)。定期觀察并拍照，若有能生長(zhǎng)的突變體幼苗，作為候選突變體，將之移栽到土壤中培養(yǎng)。

1.3 鑒 定

1.3.1 不同濃度甘露醇處理下發(fā)芽率比較

分別將野生型和突變體種子點(diǎn)種在含有不同濃度甘露醇（0、100、200、300mmol／L）的 MS培養(yǎng)基中，成5×10矩陣，培養(yǎng)皿封口后放入4℃冰箱中春化2d后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)芽率。

1.3.2 不同濃度甘露醇處理下根長(zhǎng)比較

突變體和野生型均以20粒種子點(diǎn)種在含有不同濃度甘露醇（0、50、100、150mmol／L）的1／2MS培養(yǎng)基上成一直線，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，經(jīng)過(guò)4℃冰箱春化2d，置于培養(yǎng)室中豎直培養(yǎng)20～25d后，記錄幼芽根長(zhǎng)。

1.3.3 脯氨酸質(zhì)量比的測(cè)定

取在澆有不同濃度甘露醇（0、100、200、300、400mmol／L）營(yíng)養(yǎng)液的土壤中生長(zhǎng)21d一致的擬南芥野生型和突變體幼苗，用分光光度法［6］測(cè)定脯氨酸質(zhì)量比。測(cè)定重復(fù)3次。

1.3.4 葉綠素質(zhì)量比的測(cè)定

野生型和突變體播種于澆有不同濃度甘露醇（0、200、300mmol／L）營(yíng)養(yǎng)液的土壤中生長(zhǎng)21d后，取形態(tài)大小相似的幼苗，測(cè)定葉綠素質(zhì)量比［6］。測(cè)定重復(fù)3次。

1.3.5 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

野生型和突變體播種于澆有不同濃度甘露醇（0、100mmol／L）營(yíng)養(yǎng)液的土壤中生長(zhǎng)21d后，取形態(tài)大小相似的幼苗，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率［6］。測(cè)定重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選

2.1.1 擬南芥抗旱突變體的篩選濃度的確定

不同甘露醇濃度下擬南芥野生型發(fā)芽率情況如圖1所示。從圖1可以看出，隨著甘露醇濃度的升高，擬南芥野生型種子發(fā)芽率逐漸降低，以野生型幾乎不能發(fā)芽或者發(fā)芽不能存活的甘露醇濃度為臨界篩選濃度，所以本實(shí)驗(yàn)確定甘露醇濃度為350mol／L為抗旱突變體的篩選濃度。

圖1 不同甘露醇濃度下擬南芥野生型發(fā)芽率比較

2.1.2 擬南芥抗旱突變體的篩選

在甘露醇篩選濃度為350mmol／L下能萌發(fā)生長(zhǎng)的突變體幼苗，作為候選突變體，如圖2所示。

圖2 甘露醇濃度為350mmol／L時(shí)篩選的2株候選突變體

圖2箭頭所示X1、X2為發(fā)芽較好的幼苗，挑選出來(lái)移栽到土壤培養(yǎng)基中作為候選突變體培養(yǎng)。

2.1.3 擬南芥候選抗旱突變體的土壤培養(yǎng)

由于基因突變的復(fù)雜性及環(huán)境等因素的影響，移栽到土壤培養(yǎng)基中的候選突變體，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，最后有1株候選突變體成活，命名為vem1。

vem1的整個(gè)生長(zhǎng)周期如圖3所示。

圖3 候選突變體的生長(zhǎng)周期

2.2 鑒定

2.2.1 不同濃度甘露醇處理下發(fā)芽率的比較

不同濃度甘露醇處理下野生型和vem1的發(fā)芽率情況如圖4所示。

MS培養(yǎng)基中（甘露醇0mmol／L），突變體vem1與野生型發(fā)芽率無(wú)明顯差異；甘露醇濃度為100、200、300mmol／L時(shí)，突變體vem1與野生型發(fā)芽率有明顯差異，突變體vem1發(fā)芽率分別比野生型高22%、40%、22%。隨著甘露醇濃度的提高，兩者發(fā)芽率都有下降，但是突變體vem1發(fā)芽率降低的趨勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型，說(shuō)明在甘露醇模擬的干旱脅迫下，突變體vem1相比于野生型有較高的抗性。

圖4 不同濃度甘露醇處理下野生型和vem1的發(fā)芽率

2.2.2 不同濃度甘露醇處理下根長(zhǎng)的比較

不同濃度甘露醇處理下野生型和vem1的根長(zhǎng)情況如圖5所示，相同濃度甘露醇脅迫條件下，vem1植株平均根長(zhǎng)比野生型長(zhǎng)。在甘露醇濃度為0、50、100、150mmol／L時(shí)，vem1植株平均根長(zhǎng)分 別 比 野 生 型 長(zhǎng) 28.6%、49.4%、10.5% 和14.3%。這說(shuō)明vem1在干旱條件下長(zhǎng)勢(shì)比野生型好，根長(zhǎng)較長(zhǎng)可增加植株吸收礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

圖5 不同濃度甘露醇處理下野生型和vem1的根長(zhǎng)比較

2.2.3 不同濃度甘露醇處理下脯氨酸質(zhì)量比

隨著甘露醇脅迫濃度的提高，野生型和突變體擬南芥植株的脯氨酸質(zhì)量比都隨之增加，但突變體vem1的脯氨酸質(zhì)量比增加十分顯著，如圖6所示。

圖6 不同濃度甘露醇處理下脯氨酸質(zhì)量比

甘露醇濃度為200、300mmol／L時(shí)，vem1的脯氨酸質(zhì)量比分別比野生型增加了190.8%和180.9%。脯氨酸具有易于水合的趨勢(shì)和較強(qiáng)的水合能力，植物在干旱脅迫下，通過(guò)提高體內(nèi)脯氨酸含量，增加了細(xì)胞液的濃度，提高了細(xì)胞的滲透壓，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。此外，脯氨酸作為活性氧的清除劑，保護(hù)蛋白質(zhì)分子［7］，故干旱脅迫下植株體內(nèi)迅速累積脯氨酸，對(duì)提高植物的抗旱性具有重要意義［8］。

2.2.4 不同濃度甘露醇處理下葉綠素質(zhì)量比

野生型和突變體vem1在不同濃度甘露醇處理下葉綠素質(zhì)量比的變化如圖7所示。

圖7 不同濃度甘露醇處理下葉綠素質(zhì)量比的變化

植物在干旱脅迫下，水分不足光合作用下降，葉片黃化，葉綠素質(zhì)量比降低［9－10］。由圖7可以看出，隨著甘露醇脅迫濃度的提高，葉綠素質(zhì)量比下降，300mmol／L甘露醇處理下下降最為明顯。同等甘露醇濃度下，突變體vem1植株葉綠素質(zhì)量比明顯高于野生型，進(jìn)一步驗(yàn)證了突變體vem1具有較好的抗旱性。

2.2.5 不同濃度甘露醇處理下相對(duì)電導(dǎo)率

野生型和突變體vem1在不同濃度甘露醇處理下相對(duì)電導(dǎo)率的變化如圖8所示，甘露醇濃度為100mmol／L下，野生型和突變體vem1的相對(duì)電導(dǎo)率均高于0mmol／L下的電導(dǎo)率，這是由于植物在逆境下細(xì)胞膜容易破裂，膜蛋白受傷害使胞質(zhì)液外滲，故相對(duì)電導(dǎo)率增大。突變體vem1的相對(duì)電導(dǎo)率比野生型低，表明突變體vem1膜蛋白受損較小，即突變體vem1較野生型更抗旱。

圖8 不同濃度甘露醇處理下相對(duì)電導(dǎo)率的變化

3 討 論

目前對(duì)干旱的研究主要集中在植物抗旱機(jī)理的揭示和抗旱植株的篩選與育種2個(gè)方面［11－12］。發(fā)現(xiàn)和克隆與干旱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的組分是探索其分子機(jī)制和應(yīng)用的首要條件，因此篩選與干旱脅迫相關(guān)的突變體并對(duì)其進(jìn)行研究非常重要［13］。本實(shí)驗(yàn)采用以發(fā)芽率為指標(biāo)、以甘露醇模擬水分脅迫來(lái)進(jìn)行擬南芥抗旱突變體的篩選。

植物抗旱可通過(guò)滲透調(diào)節(jié)、質(zhì)膜保護(hù)和抗氧化防御系統(tǒng)等應(yīng)激反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)［14］。植物在經(jīng)受干旱脅迫時(shí)，通過(guò)細(xì)胞對(duì)干旱信號(hào)的感知和傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，產(chǎn)生新蛋白質(zhì)，從而引起大量形態(tài)、生理和生化上的變化。干旱脅迫對(duì)植物在細(xì)胞、器官、個(gè)體及群體等水平上的形態(tài)指標(biāo)有顯著影響，也會(huì)影響其光合作用、滲透調(diào)節(jié)及抗氧化系統(tǒng)等生理生化指標(biāo)?？购低蛔凅w相對(duì)野生型，其根部較為發(fā)達(dá)，含有較高水平的脫落酸和脯氨酸［15］，具有較高的抗氧化脅迫的能力［16］。本實(shí)驗(yàn)中，突變體vem1相對(duì)于野生型表現(xiàn)出了較好的抗旱性，表現(xiàn)為發(fā)芽率、脯氨酸質(zhì)量比、葉綠素質(zhì)量比相對(duì)較高，根長(zhǎng)抑制較輕，相對(duì)電導(dǎo)率較低等。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以確定vem1是擬南芥抗旱突變體。然而此突變體以何種信號(hào)途徑調(diào)控其抗旱則有待下一步的研究，即利用Tail－PCR克隆出相應(yīng)的基因，進(jìn)一步解析干旱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其應(yīng)答脅迫的分子機(jī)制。

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