楊成德， 姜紅霞， 陳秀蓉＊， 薛 莉， 蒲崇建， 滕學琴， 孟向榮

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 甘肅省草業(yè)工程實驗室中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，蘭州 730070；3.甘肅省植保植檢站，蘭州 730020）

馬鈴薯（Solanum tuberosumLinn.）屬茄科作物，主要作糧食、蔬菜和飼料。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，全世界所有糧食作物中，馬鈴薯總產(chǎn)量排名第四。甘肅省87個縣（市、區(qū)）中有60個縣種植馬鈴薯，甘肅定西有著“馬鈴薯之鄉(xiāng)”之稱，馬鈴薯是當?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟來源，也是該地區(qū)發(fā)展經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)之一。馬鈴薯炭疽?。╞lack dot disease）廣泛分布于英國、意大利、加拿大和美國等50多個國家和地區(qū)［1］，可以發(fā)生在馬鈴薯的各個生長部位，如地下部分（子塊莖、匍匐枝、根）、莖基部及葉部［2］；該病菌侵染根部能引起根的腐爛，侵染維管束造成萎蔫，嚴重時引起皺縮和枯萎，與黃萎?。╒erticillium dahliae Kleb.）等復合侵染時可引起馬鈴薯的早 衰 病 （potato early dying，PED）［3］；據(jù) Tsror等［4］報道，在1994－1996年所試驗的5個馬鈴薯品種中，該病害使馬鈴薯減產(chǎn)22%～30%，但不同年份的影響有差異，且接種病原菌后對馬鈴薯塊莖品質(zhì)的影響也不同。馬鈴薯炭疽病由半知菌亞門炭疽菌屬的球炭疽菌［Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes］引起［5］，該病菌抗逆能力強，存活時間長，能以小菌核的形式在塊莖表面和內(nèi)部長期存活，還可存活于其他營養(yǎng)體上［6］。據(jù)2010年和2011年調(diào)查，馬鈴薯炭疽病在甘肅省定西市安定區(qū)、渭源縣、隴南市武都區(qū)和武威市天祝縣等地發(fā)生較重，重病田病株率在30%以上，導致植株早枯，且貯藏期引起爛窖，嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，已成為馬鈴薯的主要病害之一。馬鈴薯炭疽病在國內(nèi)以前作為檢疫對象，在生長期及貯藏期的研究資料較少。因此，本試驗通過在甘肅省不同馬鈴薯種植區(qū)采集標樣，進行癥狀觀察和通過形態(tài)學特征及ITS序列分析鑒定了病原，并進行了室內(nèi)毒力測定，以期為該病害的識別和防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試標本：采集于定西市安定區(qū)、隴南市武都區(qū)和武威市天?？h馬鈴薯病田及馬鈴薯貯藏庫。

供試儀器：水平凝膠電泳裝置（Bioneer公司）；MyGenie32Thermal Block PCR熱循環(huán)儀（Bioneer公司）；凝膠成像系統(tǒng) Uvitec A－6030（Bioneer公司）；高速冷凍離心機（Biometra公司）等。

供試生化試劑：蛋白酶K、溶菌酶、DNATaq聚合酶和LD2000Marker購于上海生工生物技術(shù)公司；其他試劑均采用國產(chǎn)分析純。選用通用引物ITS1和ITS4（上海生物工程有限公司合成）為擴增引物，引物序列分別如下，ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG C；ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。

供試化學農(nóng)藥：70%丙森鋅可濕性粉劑（天津市阿格羅帕克農(nóng)藥有限公司）；70%代森錳鋅可濕性粉劑（天津施普樂農(nóng)藥技術(shù)有限公司）；68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑（先正達作物保護有限公司）；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（新加坡利農(nóng)私人有限公司）；75%百菌清可濕性粉劑（利民化工有限責任公司）；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（先正達作物保護有限公司）；32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯懸浮劑（先正達作物保護有限公司）；30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑乳油（先正達作物保護有限公司）；1.5%噻霉酮水乳劑（陜西西大華特科技實業(yè)有限公司）；50%嘧菌酯懸浮劑（英國先正達有限公司）；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（拜耳作物科學公司）；50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（德國先靈農(nóng)業(yè)化學有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標本采集和分離

在2009年8月和2010年3月在甘肅省馬鈴薯主要種植區(qū)的馬鈴薯田間和貯藏庫中分別采集不同時期的發(fā)病植株和塊莖，進行癥狀描述，后進行常規(guī)組織分離培養(yǎng)，將分離獲得的真菌鏡檢，炭疽菌屬真菌進行致病性測定。

1.2.2 病原物致病性測定

在健康生長的馬鈴薯植株莖稈上，用撥針造成微傷，再將菌液噴霧于微傷口處，保濕48h之后置于良好的生長環(huán)境中，定期觀察接菌馬鈴薯植株，形成典型癥狀后進行再分離和鑒定，以接種無菌水為對照。經(jīng)致病性測定具有致病能力的病原物進行以下試驗。

1.2.3 病原菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學鑒定

將培養(yǎng)10～15d的炭疽病菌或發(fā)病部位病原菌制片，光學顯微鏡（10×40倍）下觀察孢子形態(tài)、分生孢子盤及剛毛的特征，測定分生孢子、分生孢子盤和剛毛的大?。y定50個），并拍照。根據(jù)病原形態(tài)特征，參考相關(guān)資料［7－8］，確定屬種。

1.2.3.2 ITS序列鑒定

將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在28℃、150r／min條件下振蕩培養(yǎng)5～7d后收集菌絲體，采用上海生物工程有限公司的UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取炭疽病菌基因組DNA，取5μL電泳檢查提取結(jié)果。rDNA－ITS的擴增利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（TCC GTA GGT GAA CCT GCG C）和ITS4（TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC）進行PCR擴增。擴增使用50μL擴增體系，即為：10×PCR Buffer 5.0μL，TaqDNA 聚 合 酶 （2U／μL）1.2μL，ITS1（10mmol／L）2.0μL，ITS4（10mmol／L）2.0μL，dNTP（10mmol／L）3.0μL，DNA 模板（10ng／μL）2.0μL（以加2.0μL ddH2O為陰性對照），ddH2O 34.8μL。擴增程序：94 ℃ 預(yù)變性3min，30個循環(huán)中，94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸8min。擴增后取5μL擴增產(chǎn)物電泳檢查擴增結(jié)果，具特異性條帶的擴增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。所測序列進入 GenBank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行相似性分析，并與GenBank中的相似序列在Clustal（1.81）程序包中進行多重序列匹配排列（multiple alignmemts）分析，形成一個多序列匹配排列陣，其中形成的缺口用橫杠“－”填補，用 Mega（4.0）程序包中的Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 病原菌的室內(nèi)毒力測定

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，供試殺菌劑的試驗濃度分別為肟 菌 · 戊唑醇 90、45、22.5、11.25μg／mL 和5.63μg／mL；噻霉酮24、12、6、3μg／mL和1.5μg／mL；嘧菌酯49.92、24.96、12.48、6.24μg／mL 和3.12μg／mL；丙環(huán)唑 · 苯醚甲 環(huán) 唑 1.94、1.52、1.164、0.766μg／mL和0.388μg／mL；苯醚甲環(huán)唑8、6.4、4.8、3.2μg／mL 和1.6μg／mL；苯醚甲環(huán)唑·嘧 菌 酯 4.06、3.25、1.44、1.62μg／mL 和0.81μg／mL；咪鮮胺錳鹽8.75、7、5.25、3.5μg／mL和1.75μg／mL；精甲霜·錳鋅2 560、1 280、640、320μg／mL和160μg／mL；丙森鋅80、56、32、16μg／mL和8μg／mL；代森錳鋅80、56、32、16μg／mL和8μg／mL；百菌清80、56、32、16μg／mL和8μg／mL；甲基硫菌靈80、56、32、16μg／mL和8μg／mL。

采用生長速率法測定不同藥劑對馬鈴薯炭疽病菌的抑制率［9］。將供試菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)30℃培養(yǎng)5～7d，用打孔器打取直徑4mm的菌餅接種于相應(yīng)濃度的含藥PDA平板培養(yǎng)基中央，置于生化培養(yǎng)箱中30℃ 恒溫培養(yǎng)，3次重復，以加等量無菌水的平板培養(yǎng)基為對照；4d后每天用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑對馬鈴薯炭疽病菌的抑制率、毒力回歸方程和EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

馬鈴薯炭疽病在塊莖、莖稈、葉片等部位均可發(fā)生。馬鈴薯根部和匍匐枝上發(fā)病時出現(xiàn)大量黑色的斑點狀分生孢子盤，且分生孢子盤上褐色剛毛明顯（圖1a）；塊莖發(fā)病形成近圓形或不規(guī)則形大斑，呈褐色或灰色（圖1b），后逐漸褐色腐爛，略下陷，病健交界明顯，其上有黑色小點，為病原菌形成的分生孢子盤。葉部發(fā)病癥狀多不明顯，偶爾早期顏色變淡，在葉柄和小葉上形成褐色至黑褐色病斑；在生長中期可在莖稈上形成褐色條形病斑且不斷擴大（圖1c），其上也可以形成分生孢子盤，后期莖稈逐漸萎蔫并枯死，在枯死的莖稈外表皮或皮層內(nèi)部形成大量的黑色顆粒狀物，為小菌核（圖1d）。

2.2 病原菌的分離與致病性測定

經(jīng)常規(guī)組織分離培養(yǎng)，在顯微鏡下檢查分離物，所有分離物中只有一種炭疽菌屬的真菌，在PDA培養(yǎng)基上該菌新鮮菌絲無色，老菌絲呈淺褐色，在培養(yǎng)皿中央形成大量黑色分生孢子盤和小菌核（圖2），將該分離物接種于馬鈴薯進行致病性測定。

在接種后的馬鈴薯植株莖稈上，約30d后出現(xiàn)馬鈴薯炭疽病的典型癥狀（圖3）。初期形成褐色斑點，之后莖稈上逐漸形成灰褐色條形斑，且不斷擴大，后期莖稈逐漸萎蔫并枯死，并且壞死部分呈灰白色，而在枯死的莖稈表面形成大量的黑色顆粒狀物，鏡檢為病原菌的分生孢子盤，且與所接種的病原菌形態(tài)一致，在PDA培養(yǎng)基上再次分離得到了該病原菌。因此，確定該分離物為馬鈴薯炭疽病的病原物，并對該菌進行了以下試驗。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 病原形態(tài)學鑒定

該菌菌絲無色至淺褐色，有隔膜，分生孢子盤黑褐色，長88～120μm（平均109.0μm），常生于寄主表皮下，盤上產(chǎn)生褐色、有分隔、頂部漸尖的剛毛6～7根，長40～90μm（平均61.8μm），分生孢子梗無色，具分隔，緊密排列在分生孢子盤上，單個頂生分生孢子；分生孢子無色，單胞，長橢圓形或桿狀，大小為（16～19）μm（17.3μm）× （3.6～4.8）μm（4.3μm）（圖4右圖中箭頭所指）。

根據(jù)病原形態(tài)特征，參考相關(guān)文獻［7－8］鑒定該菌為半知菌亞門（Deuteromycotina）腔孢綱（Coelomycetes）黑盤孢目（Melanconiales）炭疽菌屬（Colletotrichum）的球炭疽菌［Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes］。

圖4 馬鈴薯炭疽病病原形態(tài)

2.3.2 病原菌的ITS序列鑒定

采用UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取炭疽病菌基因組DNA，經(jīng)電泳檢測，有兩個重復其特異性、純度和完整性能滿足PCR擴增的要求（圖5）。

圖5 炭疽病菌基因組DNA電泳

在引物ITS1和ITS4的引導下，PCR擴增30個循環(huán)，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker－DL2 000為對照，在500bp附近有一條明顯的特異性擴增條帶，即為獲得的目的ITS rDNA片段（圖6），將該擴增產(chǎn)物送上海生工測序。

圖6 炭疽病菌ITS rDNA PCR電泳

將所測定的炭疽病菌的ITS rDNA序列輸入GenBank中比對后，與EU400141.1 Colletotrichum coccodes、HM171679.1 Colletotrichum coccodes 和FJ545227.1 Colletotrichum coccodes等7個序列相似性在100%，搜索下載這些相似性最高的序列，并使用Clustal（1.8）進行多重序列比較，再用 Mega 4.0軟件以最大簡約法（Neighbor－Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），炭疽病菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中與EU400141.1（570bp）Colletotrichum coccodes聚在一起，其為2008年由加拿大學者上傳，說明其親緣關(guān)系最近。該結(jié)果從分子水平進一步鑒定該病原菌為Colletotrichum coccodes，該病害為馬鈴薯炭疽病。

圖7 炭疽病菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 馬鈴薯炭疽病菌的室內(nèi)藥劑篩選

2.4.1 對馬鈴薯炭疽病菌菌絲的抑制效果

表1表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑90μg／mL抑菌率最高，達91.65%，68%精甲霜·錳鋅可濕性粉劑抑菌作用較差，2 560μg／mL時抑菌率為84.33%，160μg／mL時僅為16.04%。12種供試藥劑在試驗濃度下對炭疽病菌菌絲的生長均有不同程度的抑制作用，其抑制率隨濃度的增大而增加，不同藥劑間抑制率也差異明顯。

2.4.2 12種殺菌劑的毒力比較

表2表明，所選的12種化學農(nóng)藥對馬鈴薯炭疽病菌都有一定的抑制效果，其中70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑乳油、32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、1.5%噻霉酮水乳劑的EC50（μg／mL）值小于10，說明馬鈴薯炭疽病菌對這幾種藥劑非常敏感；50%嘧菌酯懸浮劑、75%百菌清可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑的 EC50在10μg／mL到85μg／mL之間，小于100μg／mL，即馬鈴薯炭疽病菌對這幾種藥劑較敏感；68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑的抑制效果較差，其EC50為734.30μg／mL，說明馬鈴薯炭疽病菌對該藥劑敏感性較差。該結(jié)果表明70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑乳油、32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、1.5%噻霉酮水乳劑在理論上為馬鈴薯炭疽病化學防治中較好的化學農(nóng)藥。12種不同藥劑的EC50（μg／mL）值由小到大依次為70%甲基硫菌靈可濕性粉劑＜10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑＜30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑乳油＜32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯懸浮劑＜75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑＜50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑＜1.5%噻霉酮水乳劑＜50%嘧菌酯懸浮劑＜75%百菌清可濕性粉劑＜70%丙森鋅可濕性粉劑＜70%代森錳鋅可濕性粉劑＜68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑。

表1 12種殺菌劑對馬鈴薯炭疽病菌的相對抑制率1）

表2 12種殺菌劑對馬鈴薯炭疽病菌的毒力測定

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯炭疽病除了危害馬鈴薯外，還可以侵染包括葫蘆科、茄科等13個科的35種寄主，在我國僅吉林省和山東省有記錄［10］。其病原球炭疽菌（C.coccodes）以小菌核的形式在塊莖、作物的碎屑或土壤中存活很長時間，53%的小菌核埋藏在松軟的土層2.5cm下，在潮濕的條件下可以存活83周［11］；受侵染的塊莖種植在田間后，植株表現(xiàn)為生長緩慢，莖部、子塊莖都顯示病癥。Cullen等［6］用PCR技術(shù)分別從英國3個地區(qū)的5年、8年、13年未種植過馬鈴薯的土壤中檢測到了該病菌的存在，證實了土壤是該病菌一種主要的侵染來源，即土壤帶菌就成為一種有效的接種體［12］。據(jù)2010年和2011年調(diào)查，馬鈴薯炭疽病在甘肅省多個縣（區(qū)）馬鈴薯生長期和貯藏期發(fā)生，發(fā)病輕的田塊生長不良，發(fā)病重的田塊植株早枯，嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時進入貯藏期造成塊莖腐爛，其已成為甘肅省馬鈴薯生產(chǎn)上的重要病害之一。本試驗室內(nèi)毒力測定中70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、30%丙環(huán)唑·苯醚甲環(huán)唑乳油、32.5%苯醚甲環(huán)唑·嘧菌酯懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、1.5%噻霉酮水乳劑對馬鈴薯炭疽病菌的EC50較小，理論上為防治效果較好的化學農(nóng)藥；50%嘧菌酯懸浮劑、75%百菌清可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑對馬鈴薯炭疽病也有一定的防治效果。該結(jié)果為馬鈴薯炭疽病的化學防治提供了理論依據(jù)。

［1］ Johnson D A，Miliczky E R.Distribution and development of black dot，Verticilliumwilt，and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State［J］.Plant Disease，1993，77：74－79.

［2］ Pavlista A，Kerr E D.Black dot of potato caused by Colletotrichum coccodes in Nebraska［J］.Plant Disease，1992，76：1077.

［3］ 劉會梅，王向軍，封立平.馬鈴薯炭疽病研究進展［J］.植物檢疫，2007，21（1）：38－41.

［4］ Tsror L，Erlich O，Hazanovsky M.Effect of Colletotrichum coccodes on potato yield，tuber quality，and stem colonization during spring and autumn［J］.Plant Disease，1999，83：561－565.

［5］ Hooker W J.Compendium of potato diseases［M］.Washington：the American Phytopathological Society，2003：26－27.

［6］ Cullen D W，LeesA K，Toth I K，et al.Detection of Colletotrichum coccodes from soil and potato tubers by conventional and quantitative real－time PCR［J］.Plant Pathology，2002，51，281－292.

［7］ 戴芳瀾.中國真菌總匯［M］.北京：科學出版社，1979.

［8］ 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1979.

［9］ Marais L.Efficacy of fungicides against Colletotrichum coccodes on potato tubers［J］.Potato Research，1990，33：275－281.

［10］ 姚文國，崔茂森.馬鈴薯有害生物及其檢疫［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［11］ Blakeman J P，Hornby D.The persistence of Colletotrichum coccodes and Mycosphaerella ligulicolain soil with special reference to sclerotia and conidia［J］.Transactions of the British Mycological Socicty，1966，49：227－240.

［12］ Denner F D N，Millard C，Wehner F C.Effect of seed and soilborne inoculum of Colletotrichum coccodes on the incidence of black dot on potatoes［J］.Potato Research，1998，41：51－56.