張慧麗， 王建峰， 段維軍， 徐 瑛， 高姍姍， 陳先鋒＊

（1.寧波出入境檢驗檢疫局，寧波 315012；2.寧波大學(xué)，寧波 315211）

華麗腐霉（Pythium splendens Braun）引起的油棕猝倒病是油棕上的一種重要真菌病害［1］，該病菌寄主范圍很廣，除侵染油棕苗以外，還能危害上百種經(jīng)濟作物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫［2］。它主要分布在比利時、法國、德國、意大利、荷蘭、日本、坦桑尼亞、剛果和美國的夏威夷、佛羅里達、賓夕法尼亞州，國內(nèi)臺灣、海南曾有報道［2－4］，但其他地區(qū)未見發(fā)生報道。該病菌通過帶菌土壤、生長介質(zhì)和營養(yǎng)繁殖材料傳播。在2007年被列入中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄。針對P.splendens的檢 測 已 有 特 異 性 引 物［5］、PCR－RFLP［6］、核 糖 體DNA序列分析［4］等方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光PCR以其具有的高特異性、高靈敏度以及快速的優(yōu)點越來越多地應(yīng)用于疫病的檢測。

真核生物核糖體 DNA（rDNA）由18S、ITS1（internal transcribed space）、5.8S、ITS2 和 28S構(gòu)成，頭尾串聯(lián)形成重復(fù)序列，一個基因組內(nèi)有60～200個拷貝。ITS1和ITS2常被合稱為ITS，并且5.8SrDNA基因也被包括在ITS之內(nèi)。rDNA上5.8S、18S和28SrDNA基因序列進化緩慢而相對保守，但這三個基因序列之間的ITS序列的進化則相當(dāng)迅速，因而rDNA序列廣泛用于真菌各級水平的系統(tǒng)學(xué)研究［7］。本研究通過對病原菌及相關(guān)種的rDNA ITS序列進行比較分析，設(shè)計了針對P.splendens的引物和探針，建立了P.splendens實時熒光PCR檢測方法，為口岸檢驗檢疫提供快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

供試菌株包括了腐霉屬12種、疫霉屬2種以及一些常見真菌、細(xì)菌共17種21個菌株。菌株編號和來源見表1。

表1 參試菌株及來源

1.2 DNA提取

將供試真菌菌株采用CTAB法提取總DNA［8］，細(xì)菌菌株采用TaKaRa minibest bacterial genomic DNA extraction kit ver.2.0 試 劑 盒 提 取 DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR檢測

1.3.1 引物及探針的設(shè)計與合成

使用Bioedit軟件對GenBank中的病原菌及相關(guān)種的rDNA ITS序列進行比較分析，找出保守序列，應(yīng)用 Primer Express 5.0設(shè)計P.splendens的引物和探針。實時熒光PCR引物pyspF序列為5′－TTAAATGGACAGGGTCTTTCTAT－3′， pyspR序 列 為 5′－TGCCGAAGTCGCCAAAAG－3′，Taqman探針 pyspT 序列為5′－CGAGCACCACACTTCACACAG－3′，探針5′端標(biāo)記的熒光報告基團為FAM，3′端標(biāo)記的熒光猝滅基團為TAMRA。熒光探針與引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3.2 實時熒光PCR反應(yīng)體系和程序

PCR反應(yīng)總體積為25μL，各成分為：1×Premix Ex TaqTM（大連寶生物），引物0.5μmol／L，探針0.2μmol／L，校正熒光 ROX 0.2μmol／L。在ABI 7900定量PCR儀（美國ABI）上進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：50℃預(yù)熱2min；95℃預(yù)變性10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)。實時熒光PCR利用ABI 7900型熒光定量PCR儀自帶軟件SDS3.0（版本號）進行結(jié)果分析，根據(jù)陰性對照結(jié)果設(shè)定閾值線，擴增曲線及樣品Ct值由軟件自動生成。

1.3.3 特異性檢測

以表1中菌株的基因組DNA為試驗材料，用P.splendens的種特異性引物PyspF／PyspR及探針PyspT行實時熒光PCR檢測，并設(shè)置空白對照。

1.3.4 靈敏度檢測

為確定油棕猝倒病菌實時熒光PCR的檢測限度，將菌株 ATCC96757 的 DNA 稀 釋 成12、1.2、0.12、0.012、0.001 2、0.000 12、0.000 012、0.000 001 2ng／μL 8個不同濃度，分別用引物PyspF／PyspR及探針PyspT進行實時熒光PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 華麗腐霉的特異性檢測

對表1所列供試菌株進行實時熒光PCR檢測結(jié)果表明，只有P.splendens的5個菌株的模板檢測到信號增加，擴增反應(yīng)呈陽性，而其他參試菌株及空白對照在40個擴增周期內(nèi)未見信號增長，擴增反應(yīng)呈陰性（圖1）。實時熒光PCR特異性良好。

圖1 油棕猝倒病菌實時熒光PCR特異性擴增結(jié)果

2.2 靈敏度檢測試驗

對不同稀釋度的P.splendens DNA樣品，采用實時熒光PCR檢測，結(jié)果表明，實時熒光PCR方法對低至0.012pg／μL的DNA樣品有明顯擴增（圖2），系列稀釋的擴增曲線的Ct值在12～38之間，擴增曲線典型。方法的重復(fù)性良好。同時，DNA稀釋度與Ct值呈良好的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)0.999 5，相鄰10倍稀釋度的Ct值差為3.58左右（圖3），結(jié)果可靠。

3 討論

一直以來，形態(tài)學(xué)分類在腐霉分類中占主要地位，近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物技術(shù)已經(jīng)逐漸成為腐霉屬菌物分類的一種重要的輔助工具，應(yīng)用于P.splendens的分子方法包括特異性引物、PCR－RFLP、核糖體DNA序列分析等。形態(tài)學(xué)鑒定有經(jīng)驗性強、耗時長等缺點；已有的分子生物學(xué)方法中特異性引物的靈敏度不高，在研究過程中我們采用 Wang等［6］設(shè)計的特異性引物對DNA濃度為12ng／μL的樣品進行檢測，結(jié)果無擴增。PCRRFLP需要PCR擴增后再進行后續(xù)檢測，耗時較長；核糖體DNA序列分析，擴增好的PCR產(chǎn)物需要送到專業(yè)公司進行測序，雖然獲得的信息量大，但是耗時更長。而實時熒光PCR檢測方法正好克服了以上的缺點，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR過程，具有檢測周期短、特異性與靈敏度高以及無需PCR后處理等優(yōu)點。目前，還未見P.splendens實時熒光檢測方法的報道。本研究建立的實時熒光PCR檢測方法特異性強、靈敏度高。符合口岸檢測快速、準(zhǔn)確的要求。

［1］ Aderungboye F O，Esuruoso O F.Ecological studies on Pythium splendens Braun in oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）plantation soils［J］.Plant and Soil，1976，44（2）：397－406.

［2］ CMI.Descriptions of pathogenic fungi and bacteria［M］.Commonwealth Mycological Institute，Kew，United Kingdom，1966，No.120.

［3］ Fu C H，Chen C M，Hsieh H J.First report of formosan michelia seedling root rot caused by Pythium splendens in Taiwan［J］.Plant Disease，2005，89（12）：1361.

［4］ 陳秀賢，曾會才，何漢興，等.海南腐霉新記錄種Pythium splendens的鑒定及其對油棕苗的致病性測定［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，23（3）：321－324.

［5］ Wang P H，Wang Y T，White J G.Species－specific PCR primers for Pythiumdeveloped from ribosomal ITS1region［J］.Letters in Applied Microbiology，2003，37（2）：127－132.

［6］ Wang P H，White J G.Molecular characterization of Pythium species based on RFLP analysis of the internal transcribed spacer region of ribosomal DNA［J］.Physiological and Molecular Plant Pathology，1997，51（2）：129－143.

［7］ 陳劍山，鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（13）：3785－3786.

［8］ 易潤華，朱西儒，周而勛.簡化CTAB法快速微量提取絲狀真菌DNA［J］.湛江海洋大學(xué)學(xué)報，2003，23（6）：72－73.