范旭東， 董雅鳳， 張尊平， 任 芳， 裴光前

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家落葉果樹脫毒中心，興城 125100）

葡萄卷葉病在全世界普遍發(fā)生，危害極其嚴(yán)重?，F(xiàn)已報(bào)道的葡萄卷葉伴隨病毒共有11種，分別為GLRaV－1～9、GLRaV－Dr和 GLRaV－De［1］。裴 光前［2］等人于2010年在國內(nèi)首次報(bào)道了葡萄卷葉伴隨病毒4和5，至此我國已鑒定明確的葡萄卷葉伴隨病毒種類共有6種，即GLRaV－1～5和7。目前，檢測葡萄卷葉病毒的方法主要有指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）和實(shí)時(shí)熒光PCR法。指示植物法是把待檢材料嫁接到敏感寄主上，通過寄主癥狀表現(xiàn)來鑒定其帶毒情況。指示植物法不能有效地區(qū)分葡萄卷葉伴隨病毒的種類，且耗時(shí)較長。目前，國內(nèi)外已經(jīng)制備出多種葡萄卷葉伴隨病毒抗體，用于ELISA檢測［3－5］。ELISA 方 法 可 以短時(shí)間 內(nèi) 檢 測 較 多 的 樣品，但需要依賴商品化檢測試劑盒，費(fèi)用較高，且靈敏度不及RT－PCR方法。RT－PCR具有快速、高效、靈敏的特點(diǎn)，已廣泛運(yùn)用于葡萄卷葉病毒的檢測［6－7］。實(shí)時(shí)熒光 PCR 法是在 RT－PCR方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種可以封閉、實(shí)時(shí)定量的檢測方法，具有較高的靈敏度，目前主要運(yùn)用于單一葡萄病毒的檢測［8］。采用簡并引物和多重PCR可以同時(shí)檢測2種以上病毒，能夠大幅度提高檢測效率，降低檢測費(fèi)用。對(duì)于葡萄卷葉伴隨病毒的相關(guān)研究已有部分報(bào)道［2，10－11］，但針對(duì) GLRaV－4和5的研究報(bào)道極少［9］。我國葡萄卷葉伴隨病毒4和5的研究剛開始起步，簡便、快速、靈敏、高效的檢測方法的建立對(duì)今后這兩種病毒的田間調(diào)查及脫毒檢測具有重要意義。因此，作者在前人研究的基礎(chǔ)上，研究建立了GLRaV－4和5快速、靈敏、可靠的簡并引物和多重PCR檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄樣品

2010年于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家落葉果樹脫毒中心樣品保存圃采集健康及帶卷葉病癥狀的葡萄休眠枝條，于4℃冰箱內(nèi)保存待用。上述樣品均采用ELISA和單一PCR方法明確了攜帶葡萄卷葉伴隨病毒的狀況［7］。

1.1.2 試劑

PCR Fragment Recovery Kit、pMD18－T Vector和感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自大連寶生物公司（TaKa－Ra），M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自普洛麥格（Promega）公司。10×PCR Buffer（含20mmol／L Mg＋）、Taq酶、dNTPs購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。DNA Mark－D、Random Primer 6購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.3 引物

GLRaV－4引物為 5′－CTCAAACCAGCGGCTGTTG－3′ 和 5′－GTGATACCATATACATACCGACC－3′［9］，GLRaV－5引物為5′－CCCGTGATACAAGGTAGGACA－3′和 5′－CAGACTTCACCTCCTGTTAC－3′［10］，GLRaV－4和5簡并引物為5′－TAGACAACCATGTAYTCTATG－3′和5′－GGTATGAACAARTTCAATGC－3′［9］。上述引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成

刮取葡萄休眠枝條韌皮部100mg，采用二氧化硅吸附法［12］進(jìn)行總RNA提取。反轉(zhuǎn)錄在1.5mL滅菌離心管中進(jìn)行，依次加入純水9.0μL、Random Primer 6 1.0μL、總 RNA 5.0μL，離心混勻，95 ℃水浴5min，冰上放置2min。加入5×M－MLV buffer 5.0μL、10mmol／L dNTPs 1.5μL、200U／μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.8μL、滅菌純水2.7μL。37℃水浴10min，42℃水浴50min，70℃水浴5min。立即用于PCR擴(kuò)增或－20℃保存。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系

單一PCR反應(yīng)體系（25μL）：含10×Taq酶buffer 2.5μL、10μmol／L dNTPs 0.5μL、10μmol／L互補(bǔ)引物各0.5μL、5U／μL Taq酶0.375μL、模板cDNA 2.5μL、滅菌純水18.125μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃40s，56℃45s，72℃1min，循環(huán)35次；72℃7min；4℃終止反應(yīng)。

多重PCR反應(yīng)體系（25μL）：含10×Taq酶buffer2.5μL、10μmol／L dNTPs 1μL、10μmol／L互補(bǔ)引物（2對(duì)）各0.5μL、5U／μL Taq酶0.5μL、模板cDNA 5μL、滅菌純水14μL。PCR反應(yīng)程序與單一PCR相同。

簡并引物PCR反應(yīng)體系與單一PCR反應(yīng)體系相同。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃40s，50℃45s，72℃1min，循環(huán)35次；72℃7min；4℃終止反應(yīng)。

1.2.3 三種PCR反應(yīng)體系檢測靈敏度比較

將提取的總RNA依次稀釋至10－1～10－6倍，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別采用單一、多重、簡并引物PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，比較其檢測靈敏度。

1.2.4 簡并引物的特異性

采用簡并引物對(duì)16個(gè)攜帶 GLRaV－1、2、3、4、5、7的葡萄樣品進(jìn)行RT－PCR檢測，擴(kuò)增獲得的目的條帶切膠回收后，克隆測序，以明確簡并引物擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

2 結(jié)果

2.1 三種PCR反應(yīng)體系檢測靈敏度

單一PCR結(jié)果顯示GLRaV－4擴(kuò)增片段為442 bp，GLRaV－5擴(kuò)增片段為690bp，可以檢測出GLRaV－4和5的RNA最高稀釋倍數(shù)為10－4（圖1a和b）。多重PCR能夠同時(shí)擴(kuò)增出GLRaV－4和5，能夠檢測出GLRaV－4和5的RNA最高稀釋倍數(shù)為10－4（圖1c）。采用簡并引物從攜帶GLRaV－4和5的樣品中擴(kuò)增出371bp的目的片段，能檢測出上述2種病毒的RNA最高稀釋倍數(shù)也為10－4（圖1d和e）。上述結(jié)果表明，三種PCR反應(yīng)體系檢測GLRaV－4和5的靈敏度相同。

2.2 簡并引物的特異性

采用簡并引物對(duì)16個(gè)分別帶有GLRaV－1、2、3、7、4、5的樣品進(jìn)行 RT－PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：陰性樣品、1～3號(hào)樣品（攜帶 GLRaV－1）、4～6號(hào)樣品（GLRaV－2）、7～9號(hào)樣品（GLRaV－3）和10～12號(hào)樣品（GLRaV－7）均未擴(kuò)增出371bp的目的片段。僅13～14號(hào)樣品（GLRaV－4）和15～16號(hào)樣品（GLRaV－5）擴(kuò)增出371bp的目的片段，表明該簡并引物僅能對(duì)GLRaV－4、5進(jìn)行有效擴(kuò)增（圖2）?？寺y序結(jié)果也表明，擴(kuò)增獲得的目的片段為GLRaV－4和5的特異性片段。其中GLRaV－5基因序列 登 錄 號(hào) 為 JN226658 （590bp）、JN226660（371bp）、JN226661（371bp）；GLRaV－4基因序列登錄號(hào)為JN226659（442bp）、JN226662（371bp）、JN226663（371bp）。

圖1 單一、多重、簡并PCR靈敏度比較

3 討論

本研究采用二氧化硅吸附法提取總RNA，建立了GLRaV－4和5簡并引物和多重RT－PCR檢測方法。二氧化硅吸附法可以快速獲得高質(zhì)量的RNA［13］。采用建立的多重PCR檢測方法能同時(shí)鑒定這兩種病毒，節(jié)約檢測時(shí)間及費(fèi)用，并且其檢測靈敏度不低于單一PCR方法。本文采用Routh等人［9］已報(bào)道的簡并引物，對(duì)GLRaV－4和5檢測靈敏度與單一PCR相同，特異性測試表明該簡并引物僅能對(duì)GLRaV－4、5為陽性的樣品進(jìn)行有效擴(kuò)增，能夠運(yùn)用于脫毒工作中這兩種病毒的檢測，提高檢測效率。本試驗(yàn)所用引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過克隆、測序驗(yàn)證，均為特異性片段。綜上所述，本研究為上述兩種葡萄卷葉伴隨病毒的田間調(diào)查和脫毒樣品檢測提供了更加簡便、快速、靈敏、高效的檢測手段。

圖2 簡并引物特異性測試結(jié)果

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