張艷峰， 薛皎亮， 鞏 莎， 王 旭， 謝映平

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

柿樹（Diospyros kaki Linn.f.）是中國北方一種重要的經(jīng)濟(jì)果樹，常年受到多種蚧蟲的為害，尤以日本龜蠟蚧（Ceroplastes japonicus Green）為甚，果實(shí)減產(chǎn)常達(dá)70%［1］。日本龜蠟蚧能夠分泌蠟質(zhì)形成厚蠟殼覆蓋在蟲體背面，難以防治［1］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植食性昆蟲侵害寄主植物時(shí)，能夠誘導(dǎo)其改變揮發(fā)性氣味，天敵昆蟲可以利用這些氣味作為定位害蟲的化學(xué)信息［2－3］。近年來，茉莉酸（JA）和茉莉酸甲酯（MeJA）作為外源信號物質(zhì)，也被用來誘導(dǎo)植物揮發(fā)物吸引害蟲的捕食性和寄生性天敵［4－5］。

本文作者近年來的研究發(fā)現(xiàn)，日本龜蠟蚧的為害可以誘導(dǎo)柿樹改變其揮發(fā)性組分。一年當(dāng)中，在5月份雌成蟲產(chǎn)卵期，其為害不足以誘導(dǎo)柿樹對紅點(diǎn)唇瓢蟲具有吸引力；而7月份若蟲為害誘導(dǎo)也不能顯著提升柿樹對紅點(diǎn)唇瓢蟲的吸引；只有9月份雌成蟲嚴(yán)重為害時(shí)，受害枝葉才會對紅點(diǎn)唇瓢蟲具有招引效應(yīng)［6］。這與程家安、王海波等人認(rèn)為植物的誘導(dǎo)程度的“開關(guān)”式效應(yīng)一致，即植物的蟲害程度在一定范圍內(nèi)時(shí)，植物所表現(xiàn)的誘導(dǎo)抗性反應(yīng)的強(qiáng)度變化不大，只有當(dāng)這種蟲害的程度超過了一定的范圍時(shí)，這種抗性反應(yīng)才能明顯表現(xiàn)出來［7－8］。而在若蟲為害期使用茉莉酸甲酯（MeJA）處理柿樹后，其誘導(dǎo)揮發(fā)物對瓢蟲具有引誘作用［9］。但不同劑量的MeJA誘導(dǎo)效應(yīng)隨時(shí)間變化的規(guī)律尚不清楚。因此本文選擇日本龜蠟蚧的主要捕食性天敵－紅點(diǎn)唇瓢蟲（Chilocorus kuwanae Silvestri）為供試天敵，研究柿樹用MeJA處理后對瓢蟲吸引作用的持續(xù)性。以期掌握外源信號分子MeJA的持續(xù)作用時(shí)間和施用劑量，增強(qiáng)柿樹誘導(dǎo)防御蚧蟲的作用，開辟高效的蚧蟲生物防治新途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

位于山西省臨猗縣的柿樹林地，經(jīng)度111°27′E，緯度35°40′N，海拔700m。選用兩年生的柿樹，高1.5m，冠幅1.0m，品種為‘橘蜜柿’。

1.2 供試瓢蟲

紅點(diǎn)唇瓢蟲采自當(dāng)?shù)亓值?，采回后喂食新鮮的日本龜蠟蚧，暫時(shí)飼養(yǎng)在干凈的玻璃管中。從中挑選雌蟲在試驗(yàn)前禁食12h，用于嗅覺行為反應(yīng)的測試。

1.3 MeJA的配制和施用

采用噴霧法，先將3個(gè)劑量（20、100μL和200μL）的 MeJA（95%，Sigma）溶于2mL的95%乙醇中，再加水稀釋，配制成100mL濃度為0.05%、0.1%和0.25%的水溶液，然后噴施到樣枝的樹葉上。

不同劑量的MeJA處理對柿樹揮發(fā)物成分變化的影響：在上午10：00用3種劑量的MeJA溶液各處理5株健康的柿樹，每株樣樹選取一個(gè)樣枝噴施100mL溶液。下午13：00即MeJA處理后3h收集揮發(fā)性氣體。采氣時(shí)間為1h。

MeJA處理后誘導(dǎo)柿樹揮發(fā)物成分變化的持續(xù)效應(yīng)：同上，在上午10：00用3個(gè)劑量的MeJA溶液處理柿樹，處理后1、3、5d收集柿樹揮發(fā)性氣體。揮發(fā)物收集在下午13：00進(jìn)行。采氣歷時(shí)1h。

1.4 嗅覺行為反應(yīng)

本試驗(yàn)采用“Y”型嗅覺儀法（參照陳華才等［10］的方法并略有改進(jìn)）。處理方法同1.3，嗅覺行為試驗(yàn)在13：00－14：00之間進(jìn)行，在試驗(yàn)開始前采集新鮮葉片做味源。味源瓶中放入15g葉片，處理組為不同劑量MeJA處理的柿樹枝葉，對照均為未處理的健康柿樹枝葉。

試驗(yàn)裝置由“Y”型嗅覺儀（直管20cm，兩臂13cm，夾角60°，內(nèi)徑2.5cm）、蒸餾水瓶、活性炭過濾器、通氣泵（QC－1型大氣采樣儀）連接而成。氣流進(jìn)入味源瓶前先經(jīng)過活性炭過濾器和蒸餾水瓶，以凈化空氣和增加濕度，氣體流量200mL／min。試驗(yàn)時(shí)，在“Y”型嗅覺儀上方20cm處安置一個(gè)30W日光燈以平衡照明，減少自然光的變化對趨性試驗(yàn)的影響。室內(nèi)溫度保持在25～28℃。

試驗(yàn)時(shí)先行通氣10min。瓢蟲由直管入口逐頭引入，觀察其在10min內(nèi)對味源的行為反應(yīng)。當(dāng)瓢蟲向某一味源方向爬行到達(dá)或超過某臂的1／3處，并持續(xù)1min以上或一直到達(dá)出口的，記作對該氣味源有趨性反應(yīng)。15頭瓢蟲為一組，設(shè)6組重復(fù)。每組測定完畢后，清洗整個(gè)裝置，吹干，以消除味源殘留，同時(shí)將嗅覺儀左右調(diào)換方位，以消除昆蟲趨光性可能對試驗(yàn)結(jié)果的影響。每組重復(fù)都更換新的味源和瓢蟲。

1.5 揮發(fā)性氣體的收集與分析

1.5.1 揮發(fā)性氣體的收集

根據(jù)上述試驗(yàn)安排，在晴朗、無風(fēng)的天氣進(jìn)行，在試驗(yàn)林MeJA處理的樣樹上確定標(biāo)準(zhǔn)枝條，使用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)頂空收集法采集其揮發(fā)物。采樣裝置：由透明塑料袋（長120cm，寬80cm，此袋自身揮發(fā)物釋放量很小，可忽略）、通氣泵（QC－1型）、干燥塔（250mL）、采樣管（15cm×5mm）、裝活性炭的玻璃管（12cm×5mm），乳膠管（d＝5mm）連接而成。采樣時(shí)用塑料袋將標(biāo)準(zhǔn)樣枝套住（不脫離樹體），把裝活性炭的玻璃管從接口處通入袋內(nèi)扎緊；再經(jīng)過干燥塔連接大氣采樣儀出氣口；塑料袋底部開口插入采樣管，扎緊后連接大氣采樣儀進(jìn)氣口，以形成循環(huán)。氣體流量為100mL／min。

采樣完畢，立即用錫紙把采樣管兩端口密封，帶入實(shí)驗(yàn)室放在玻璃干燥塔內(nèi)室溫（25±2℃）保存，隨后進(jìn)行分析。

1.5.2 揮發(fā)性氣體的組分分析

采用熱脫附GC／MS（TCT－GC／MS）分析，采樣管為Sigma采樣管，內(nèi)裝吸附劑為Tenax－GR（60～80目）。儀器：TCT－GC／MS聯(lián)用儀，TCT為Chrompack公司生產(chǎn)，型號為 CPG－4010PTI／TCT，系統(tǒng)壓力20kPa；GC型號為CE Instrument公司生產(chǎn)的TraceTM2000GC，色譜柱：CP－Sil 8Low Bleed／MS柱（60m×0.32mm（id），0.5μm），MS型號為 Voy ager MS（Finnigan Thermo－Quest）：EI源，70eV；接口溫度250℃，源溫200℃，燈絲發(fā)射電流150μA。GC／MS分析：進(jìn)樣口溫度250℃，冷阱溫度－120℃（3min），熱脫附溫度250℃（10min）；冷阱進(jìn)樣時(shí)溫度260℃。程序升溫：40℃保持3min后，以6℃／min的速率升至270℃，保持3min；然后升溫至280℃，保持5min；保留時(shí)間5～46min。對每一揮發(fā)物組分的質(zhì)譜峰與標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜峰進(jìn)行聯(lián)機(jī)數(shù)據(jù)庫（Nist Library）檢索，對照確定相應(yīng)的化合物名稱、分子式、分子量和分子結(jié)構(gòu)式；用揮發(fā)物各組分的GC峰面積與總峰面積的比值計(jì)算出各組分的相對含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

揮發(fā)物定量采用峰面積歸一化法表示各成分的相對百分含量。采用卡方檢驗(yàn)分析紅點(diǎn)唇瓢蟲對不同劑量MeJA處理的柿樹揮發(fā)物的嗅覺行為反應(yīng)。用SPSS V13.0對揮發(fā)物成分進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（One－Way ANOVA），并做Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量MeJA處理柿樹后3～5d紅點(diǎn)唇瓢蟲的嗅覺行為反應(yīng)

用20、100μL和200μL MeJA處理健康柿樹，研究其在5d之內(nèi)對瓢蟲吸引力的持續(xù)效應(yīng)（表1），結(jié)果如下：應(yīng)用不同劑量的 MeJA處理柿樹后，在3h到1d范圍內(nèi)都可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生對瓢蟲的吸引力。其中最大引誘效應(yīng)出現(xiàn)在200μL MeJA處理后3h時(shí)，瓢蟲的趨向率達(dá)到78.21%，與對照21.79%相比差異極顯著（p＜0.01）。而在 MeJA處理后3d和5d，結(jié)果顯示柿葉對瓢蟲的吸引力已經(jīng)明顯減弱，與對照相比差異不顯著（p＞0.05）。因此，應(yīng)用 MeJA誘導(dǎo)柿樹產(chǎn)生對紅點(diǎn)唇瓢蟲的吸引效應(yīng)可持續(xù)一天左右，從第3天后吸引力顯著下降。

表1 紅點(diǎn)唇瓢蟲對3種劑量MeJA處理和未處理柿樹的趨性反應(yīng)比較1）

2.2 不同劑量MeJA誘導(dǎo)柿樹揮發(fā)物成分的變化

對收集到的柿樹揮發(fā)物進(jìn)行GC／MS檢測，共檢出5類組分，分別是萜烯類、醇類、酯類、烷烴類、醛類化合物，由于對天敵昆蟲起招引作用的主要是前3種，因此烷烴類、醛類化合物未在文中列出。從表2可知，與對照相比，使用MeJA處理柿樹后揮發(fā)物成分有很大的不同，后者新增了5種萜烯類、1種醇類以及1種酯類化合物。而不同劑量MeJA處理的樹體揮發(fā)物的成分存在著差別，隨著MeJA用量的增加，能夠誘導(dǎo)更多的具有吸引天敵昆蟲作用的萜烯類物質(zhì)產(chǎn)生。健康柿樹揮發(fā)物中，只有順－羅勒烯存在，占22.61%；比較MeJA處理組的揮發(fā)物組分中，α－蒎烯均為最多的萜烯類化合物，高劑量Me－JA處理后單一組分α－蒎烯含量可達(dá)到34.05%，同時(shí)揮發(fā)物中的萜烯類組分增加到6種共占49.27%。與對照組中2－乙基己醇不同，MeJA處理柿樹后僅有一種醇類物質(zhì)，即3－己烯醇，且只在100μL處理組中，僅占0.42%。酯類1種，僅存在于處理組中，且低劑量處理組中總含量最多，占11.13%。

與高含量的萜烯類揮發(fā)物相應(yīng)的是，瓢蟲的趨性反應(yīng)結(jié)果也是對200μL MeJA處理的柿樹趨向率最高（表1），與α－蒎烯的高含量相吻合。而瓢蟲對100μL MeJA處理的柿樹趨向率最低，其揮發(fā)物中萜烯類物質(zhì)種類最少，含量也最低。

2.3 MeJA誘導(dǎo)柿樹揮發(fā)物成分不同時(shí)間的變化

在MeJA處理后1、3d和5d，通過分析比較柿樹揮發(fā)物的化學(xué)成分來研究其中主要起招引作用的萜烯類、醇類和酯類化合物的變化規(guī)律。從表3可知：3種劑量的MeJA處理柿樹揮發(fā)物的持續(xù)變化相一致，即2種萜烯類，α－蒎烯和順－羅勒烯以及1種酯類物質(zhì)乙酸己烯酯差異顯著，其余物質(zhì)變化不明顯。用MeJA處理后1d，α－蒎烯都是含量最多的萜烯類物質(zhì)，到處理后3d和5d含量逐漸減少；與之形成鮮明對比的是，在處理后1d的柿樹揮發(fā)物中僅有極少量的順－羅勒烯存在，到了處理后3d，含量就達(dá)到25%以上，在處理后5d，增長進(jìn)一步加劇，達(dá)到45%左右；與α－蒎烯變化規(guī)律一致的是乙酸己烯酯在處理后柿樹的揮發(fā)物成分中隨時(shí)間增加逐步遞減。這2種化合物的變化與處理后柿樹吸引力的變化呈正相關(guān)，在處理后1d的柿樹揮發(fā)物中含量較高，對瓢蟲有吸引效應(yīng)，而在處理后3d和5d含量逐漸下降，柿樹的招引效應(yīng)也隨之逐漸減弱。順－羅勒烯的變化規(guī)律與之相反，在不具有招引效應(yīng)的處理后3d和5d的揮發(fā)物中含量很高，由此可知其并不是對紅點(diǎn)唇瓢蟲具有吸引效應(yīng)的萜烯類物質(zhì)。

表2 不同劑量MeJA處理柿葉3h揮發(fā)物主要成分的相對含量1）

表3 三種劑量的MeJA處理柿葉1d，3d，5d揮發(fā)物主要成分的相對含量1）

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，柿樹在受到外源信號物質(zhì)Me－JA誘導(dǎo)后，揮發(fā)物種類和揮發(fā)量有所改變，從而改變了柿樹揮發(fā)物的組成相，這是本次試驗(yàn)柿樹揮發(fā)物組分中普遍具有的規(guī)律。柿樹經(jīng)誘導(dǎo)后促進(jìn)了揮發(fā)物的釋放，通過吸引天敵來保護(hù)自身，達(dá)到間接防御的目的。已有相關(guān)的研究報(bào)道了害蟲的侵食和MeJA的應(yīng)用能夠誘導(dǎo)寄主植物釋放出揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)來吸引天敵昆蟲控制害蟲［11－14］。這些都進(jìn)一步印證了植物－植食性昆蟲－天敵三營養(yǎng)層次確實(shí)存在某種化學(xué)信息聯(lián)系，充分體現(xiàn)了三者之間的協(xié)同進(jìn)化。

在植物和昆蟲的長期協(xié)同進(jìn)化過程中，植食性昆蟲對寄主植物的定位與識別包括一系列對來自寄主植物和非寄主植物刺激的行為反應(yīng)［15］，同樣植物也可以產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)來抵御植食性昆蟲的危害，其主要方式是產(chǎn)生對昆蟲有毒的次生代謝物質(zhì)以及通過改變自身的揮發(fā)物來引誘植食性昆蟲的天敵來捕食和寄生［14－16］；天敵昆蟲也能夠利用植物和植食性昆蟲所釋放的信息化合物來尋找獵物［17］。目前認(rèn)為對昆蟲起定位作用的僅為一種或幾種特異性的信息化合物。如Chenier等研究發(fā)現(xiàn)松樹揮發(fā)物中的α－蒎烯對寄生針葉樹的天?？?、象甲科、小蠹蟲科、郭公甲科的昆蟲具有引誘作用［18］；順－3－己烯醇是害蟲取食后植物釋放的一種常見物質(zhì)，可以吸引捕食性天敵［19］。

本研究也證實(shí)了萜烯類、醇類、酯類化合物在MeJA誘導(dǎo)的柿樹揮發(fā)物中含量增加，尤其是α－蒎烯的含量變化與瓢蟲的趨性反應(yīng)正相關(guān)，對紅點(diǎn)唇瓢蟲具有很強(qiáng)的吸引力。隨著MeJA用量的增加，能夠產(chǎn)生更多的α－蒎烯，對應(yīng)于更多的瓢蟲趨向于高劑量MeJA處理的柿樹枝葉；在處理后隨著時(shí)間的延長，其含量逐漸下降，相應(yīng)的是對瓢蟲的招引效應(yīng)也隨之減弱。利用α－蒎烯進(jìn)行的單組分味源的趨性試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這種化合物在一定濃度下對瓢蟲具有引誘效應(yīng)［20］。

并不是所有的萜烯類、醇類物質(zhì)對天敵昆蟲都有引誘活性，本研究發(fā)現(xiàn)柿樹揮發(fā)物中順－羅勒烯的變化與對瓢蟲的吸引效應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。柿樹對瓢蟲的吸引力隨處理后時(shí)間的增加而減弱，順－羅勒烯的含量卻逐漸增加，尤其是處理后的5d其含量達(dá)到45%左右，此時(shí)的柿樹對瓢蟲不具備吸引力。與我們的結(jié)果不同的是，張鳳娟等研究了3種槭樹的揮發(fā)物成分中的羅勒烯對其蛀干害蟲－光肩星天牛具有驅(qū)避效應(yīng)［21］。

總而言之，MeJA是一個(gè)信號傳導(dǎo)物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)植物改變揮發(fā)物釋放量和組分。因此在日本龜蠟蚧若蟲為害期，林地里應(yīng)用MeJA誘導(dǎo)柿樹釋放具有吸引力的揮發(fā)物招募瓢蟲，這可為生物防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。但這些物質(zhì)在3個(gè)營養(yǎng)層的作用是一個(gè)復(fù)雜的生物反應(yīng)過程。目前的研究只是一個(gè)初步探索，因?yàn)閾]發(fā)物的化學(xué)指紋圖中各組分的特定比例對昆蟲的定向和行為極為重要，昆蟲利用植物揮發(fā)物尋找寄主和植物改變自身揮發(fā)物組成來引誘天敵的整個(gè)過程是較為復(fù)雜的，如何利用這些有效的信息化合物來實(shí)現(xiàn)害蟲的可持續(xù)控制有待進(jìn)一步的研究。

［1］ 謝映平.山西林果蚧蟲［M］.北京：中國林業(yè)出版社，1998：22－38.

［2］ Kessler A，Baldwin I T.Defensive function of herbivory－induced plant volatile emissions in nature［J］.Science，2001，291：2141－2214.

［3］ 謝映平，薛皎亮，唐曉燕.綿粉蚧危害的花椒樹對異色瓢蟲的招引作用［J］.林業(yè)科學(xué)，2004，40（2）：38－45.

［4］ Thaler J S.Jasmonate－inducible plant defences cause increased parasitism of herbivores［J］.Nature，1999，399：686－688.

［5］ Dicke M，Gols R，Ludeking D，et al.Jasmonic acid and herbivory differentially induces carnivore－attracting plant volatiles in lima bean plants［J］.Journal of Chemical Ecology，1999，25（8）：1907－1922.

［6］ Zhang Yanfeng，Xie Yingping，Xue Jiaoliang，et al.Response of a predatory insect，Chrysopa sinica，toward the volatiles of persimmon trees infested with the herbivore，Japanese wax scale［J／OL］.International Journal of Ecology，Volume 2012，Article ID 653869，6pages.

［7］ 程家安，唐振華.昆蟲分子科學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［8］ 王海波，陶蕓，金沙.蠶豆葉片幾丁質(zhì)酶活性的蚜蟲誘導(dǎo)—植物生理應(yīng)激反應(yīng)的趨同性［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，1994，5（1）：68－71.

［9］ Zhang Yanfeng，Xie Yingping，Xue Jiaoliang，et al.Attraction to the ladybeetle by the volatiles of persimmon trees induced with methyl jasmonate and Japanese wan scale attacking［J］.Scientia Silvae Sinicae，2009，45：90－96.

［10］ 陳華才，婁永根，程家安.二化螟絨繭蜂對二化螟及其寄主植物揮發(fā)物的趨性反應(yīng)［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2002，45（5）：617－622.

［11］ Dick M，Baarlen P V，Wessels R，et al.Herbivory induces systemic production of plant volatiles that attract predators of the herbivore：extraction of endogenous elicitor［J］.Journal of Chemical Ecology，1993，19：581－599.

［12］ 蘇建偉，高峰，劉玲，等.棉鈴蟲危害對轉(zhuǎn)基因棉花揮發(fā)物成分和釋放速率的影響［J］.植物保護(hù)，2007，33（1）：29－33.

［13］ 呂要斌，劉樹生.外源茉莉酸誘導(dǎo)植物反應(yīng)對菜蛾絨繭蜂寄生選擇行為的影響［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2004，47（2）：206－212.

［14］ 徐偉，嚴(yán)善春.茉莉酸在植物誘導(dǎo)防御中的作用［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25（8）：2074－2082.

［15］ 康樂，Hopkins T L.黑蝗初孵蝗喃對植物氣味和植物揮發(fā)性化合物的行為和嗅覺反應(yīng)［J］.科學(xué)通報(bào)，2004，49（1）：81－85.

［16］ 尹姣，陳巨蓮，曹雅忠，等.茉莉酸誘導(dǎo)小麥抗病蟲性初步研究［J］.植物保護(hù)，2005，31（4）：35－37.

［17］ Turlings T C J，Tumlinson J H，Lewis W J.Exploitation of herbivore－induced plant odors by host seeking parasitic wasps［J］.Science，1990，250：1251－1253.

［18］ Chenier J V R，Philogene B J P.Field responses of certain forest Coleoplera to conifer monterpenes and athanol［J］.Journal of Chemical Ecology，1989，15（6）：1929－1945.

［19］ Turlings T C J，Benrey B.Effect of plant metabolites on the behavior and development of parastic wasps［J］.EcoScience，1998，5：321－333.

［20］ Zhang Yanfeng，Xie Yingping，Xue Jiaoliang，et al.Effect of volatile emissions，especially a－pinene，from persimmon trees infested by japanese wax scales or treated with methyl jasmonate on recruitment of ladybeetle predators［J］.Environmental Entomology，2009，38（5）：1439－1445.

［21］ 張風(fēng)娟，金幼菊，陳華君，等.光肩星天牛對4種不同槭樹科寄主植物的選擇機(jī)制［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（3）：870－877.