王亞平，董瑞華，劉澤源，胡 園，劉皈陽（. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科，北京 0007；2. 河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院臨床藥理室，北京 0007；.解放軍總醫(yī)院臨床藥理室，北京 0085）

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用。CYP450可受多種因素的影響，尤其是藥物，并引起自身或其他藥物的藥代動(dòng)力學(xué)改變，使得藥效增強(qiáng)（中毒）或減弱（無效），從而導(dǎo)致藥物-藥物相互作用[1]。

近年來有關(guān)中藥活性成分對(duì)CYP450酶系影響的研究備受關(guān)注[2-3]。齊墩果酸和熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，存在于多種藥用植物中，具有多種生物學(xué)活性，如保肝、抗炎、抗腫瘤、抗HIV等[4-5]。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，齊墩果酸不經(jīng)過CYP450酶代謝，而CYP450酶參與了熊果酸的代謝[6]。本文以此為基礎(chǔ)，以人肝微粒體溫孵系統(tǒng)為模型，進(jìn)一步對(duì)比研究齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP450酶的抑制作用，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 高效液相色譜儀，包括G1311A 四元泵，G1316A 柱溫箱，G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器，G1379A在線脫氣機(jī)，G1314A VWD 可變波長紫外檢測器，G1321A FLD 熒光檢測器和HP 色譜工作站；色譜柱Krosmail 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）購自迪馬科技公司；高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

齊墩果酸、熊果酸、非那西丁、雙氯芬酸鈉、右美沙芬氫溴酸鹽、氯唑沙宗、S-美芬妥英、香豆素、呋拉茶堿、8-甲氧補(bǔ)骨脂素、槲皮素、磺胺苯吡唑、奎尼丁、克拉霉素、氯美噻唑、D-葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）、氧化性輔酶Ⅱ（NADP+）均購自Sigma公司；咪達(dá)唑侖注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；混合人肝微粒體（15例）（美國BD公司）；其余試劑為色譜純或分析純。

1.2 齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP亞型的抑制作用

200 μL孵育體系包括磷酸鉀緩沖液（pH = 7.4，100 mmol·L-1）；NADPH 生成體系（1 mmol·L-1NADP+，10 mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸，1 U·mL-1葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，4 mmol·L-1MgCl2）；肝微粒體（0.5 mg·mL-1）和底物。

在孵育體系加入NADPH生成體系前，加入CYP探針?biāo)幬锖妄R墩果酸或熊果酸 50 μmol·L-1，并以CYP探針?biāo)幬锏奶禺愋砸种苿┳鳛殛栃詫?duì)照，考察齊墩果酸或熊果酸對(duì)CYP各亞型的抑制作用。8種CYP亞型探針底物及其濃度分別為：非那西?。?0 μmol·L-1，CYP1A2）；香豆素（1.0 μmol·L-1, CYP2A6）；紫杉醇（10 μmol·L-1, CYP2C8）；雙氯芬酸（10 μmol·L-1，CYP2C9）；右美沙芬（25 μmol·L-1，CYP2D6）；氯唑沙宗（120 μmol·L-1，CYP2E1）；咪達(dá)唑侖（10 μmol·L-1，CYP3A4）；S-美芬妥英（10 μmol·L-1，CYP2C19）。CYP各亞型的抑制劑及其對(duì)應(yīng)的濃度分別為：呋拉茶堿（10 μmol·L-1，CYP1A2）；8-甲氧補(bǔ)骨脂素（2.5 μmol·L-1，CYP2A6）；槲皮素（20 μmol·L-1，CYP2C8）；磺胺苯吡唑（10 μmol·L-1，CYP2C9）；奎尼丁（10 μmol·L-1，CYP2D6）；克拉霉素（10 μmol·L-1，CYP3A4）；氯美噻唑（50 μmol·L-1，CYP2E1）；奧美拉唑（10 μmol·L-1，CYP2C19）。37 ℃預(yù)孵育3 min后，加入NADPH生成體系起始反應(yīng)，孵育一定時(shí)間后，加入100 μL甲醇或乙腈終止反應(yīng)。然后4 ℃，20 000×g離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)行HPLC分析。呋拉茶堿、8-甲氧補(bǔ)骨脂素是基于機(jī)理的抑制劑[7-9]，所以它與人肝微粒體、緩沖液和NADPH產(chǎn)生體系在37 ℃孵育20 min后，加入探針底物起始反應(yīng)，后續(xù)操作同上。探針底物及其產(chǎn)物的檢測參考文獻(xiàn)[10-11]，所有孵育樣品均做復(fù)管，結(jié)果取平均值。

為確定齊墩果酸和熊果酸是否為CYP基于機(jī)理的抑制劑，進(jìn)行NADPH-時(shí)間依賴性的抑制實(shí)驗(yàn)。齊墩果酸或熊果酸（50 μmol·L-1）和NADPH產(chǎn)生體系、人肝微粒體孵育一定時(shí)間（0，5，10，15 min），加入相對(duì)應(yīng)的底物起始反應(yīng)，并測定活性。

1.3 齊墩果酸對(duì)CYP3A4抑制常數(shù)的測定

固定人肝微粒體蛋白濃度為0.5 mg·mL-1，孵育時(shí)間為30 min，咪達(dá)唑侖的終濃度選擇10，25，50，100 μmol·L-1，作為抑制劑的齊墩果酸終濃度選擇10，25，50，100 μmol·L-1。

使用Dixon作圖法和Lineweaver-Burk作圖法來確定抑制反應(yīng)的類型，以Lineweaver-Burk作圖所得斜率同齊墩果酸濃度的二次作圖求得齊墩果酸的抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)Ki。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP亞型的抑制作用

齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP450酶活性的抑制作用結(jié)果見圖1，在考察的8種CYP亞型當(dāng)中，齊墩果酸對(duì)CYP3A4的活性抑制作用最強(qiáng)，抑制率接近50%，CYP1A2次之，對(duì)其他幾種酶的活性抑制率都在30%以下，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熊果酸對(duì)8種酶的活性抑制率均小于20%，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了測定齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP各個(gè)亞型基于機(jī)理抑制作用的活性，進(jìn)行了NADPH-時(shí)間依賴性的抑制試驗(yàn)。對(duì)所測定的CYP亞型，均沒有發(fā)現(xiàn)NADPH-時(shí)間依賴性的抑制表現(xiàn)。

圖1 齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP450酶活性的抑制率Fig 1 The inhibition ratio of oleanolic acid and ursolic acid on cytochromes P450

2.2 齊墩果酸對(duì)CYP3A4抑制常數(shù)的測定

根據(jù)抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（圖1），齊墩果酸對(duì)CYP3A4酶的活性抑制超過了50%，因此我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）和抑制常數(shù)（Ki）。齊墩果酸對(duì)CYP3A4催化咪達(dá)唑侖羥化反應(yīng)的抑制程度隨濃度增加而增強(qiáng)，在100 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，其IC50值為（35.0±5.0） μmol·L-1（圖2）。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們進(jìn)行了不同濃度的齊墩果酸對(duì)不同濃度的咪達(dá)唑侖羥化反應(yīng)抑制效果的實(shí)驗(yàn)，所得到的數(shù)據(jù)用Dixon 和Lineweaver-Burk 作圖處理（圖3和圖4）。由圖可知，齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖代謝的抑制符合混合動(dòng)力學(xué)行為，用Lineweaver-Burk作圖所得斜率與齊墩果酸濃度二次作圖求得齊墩果酸的抑制常數(shù)Ki為39.2 μmol·L-1（圖5）。

圖2 齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖羥化活性的抑制Fig 2 Inhibition effect of oleanolic acid on midazolam hydroxylation activity

圖3 齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖羥化活性抑制效應(yīng)的Dixon作圖Fig 3 Dixon plot of inhibitory effects of oleanolic acid on midazolam hydroxylation activity

圖4 齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖羥化活性抑制效應(yīng)的Lineweaver-Burk 作圖Fig 4 Lineweaver-Burk plots of inhibitory effects of oleanolic acid on midazolam hydroxylation acticity

圖5 Lineweaver-Burk作圖得到的斜率與齊墩果酸濃度的二次作圖Fig 5 Second plot of slopes from Lineweaver-Burk plot vs oleanolic acid concentrations

3 討論

本文對(duì)比研究了齊墩果酸和熊果酸對(duì)8種主要CYP亞型的抑制效果。初步篩選結(jié)果表明熊果酸對(duì)CYP450酶的活性沒有表現(xiàn)出明顯的抑制，齊墩果酸對(duì)CYP1A2的活性有輕微的抑制作用，對(duì)CYP3A4活性有明顯的抑制，在基于機(jī)理抑制的實(shí)驗(yàn)中，沒有觀察到NADPH-時(shí)間依賴性的抑制，排除了兩者對(duì)CYP基于機(jī)理抑制的可能性。我們進(jìn)一步研究齊墩果酸對(duì)CYP3A4酶的抑制常數(shù)，發(fā)現(xiàn)齊墩果酸可競爭性抑制CYP3A4探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖羥化反應(yīng)的活性，并測得抑制常數(shù)Ki為39.2 μmol·L-1。由于CYP3A4酶是人體內(nèi)一類非常重要的CYP代謝酶，臨床半數(shù)以上的藥物都要經(jīng)它代謝轉(zhuǎn)化[12]，而且許多藥物也是它的誘導(dǎo)或抑制劑，所以齊墩果酸對(duì)CYP3A4酶的抑制作用應(yīng)引起我們的注意。

鑒于齊墩果酸和熊果酸是同分異構(gòu)體，我們可以從結(jié)構(gòu)上推測導(dǎo)致兩者對(duì)CYP450酶抑制作用不同的原因。齊墩果酸和熊果酸的藥理活性基團(tuán)，比如羥基、雙鍵和羧基的位置都一致[13]，兩者的區(qū)別僅在于E環(huán)的甲基異構(gòu)，齊墩果酸的E環(huán)上兩個(gè)甲基取代都在20位C上，而熊果酸的E環(huán)上19位和20位上各有一個(gè)甲基，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以推測E環(huán)甲基取代位置可能是影響對(duì)CYP抑制效果的主要因素，至于結(jié)構(gòu)差異和抑制作用之間的關(guān)聯(lián)程度需要進(jìn)一步研究。

[1] Shapiro LE, Shear NH. Drug interactions/P450[J]. Curr Probl Dermatol, 2001, 13(3): 141-152.

[2] Wang X, Cheung CM, Lee WY,et al. Major tanshinones of Danshen (Salvia miltiorrhiza) exhibit different modes of inhibition on human CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 and CYP3A4 activities in vitro[J]. Phytomedicine, 2010, 17(11): 868-875.

[3] Xia CH, Sun JG, Wang GJ,et al. Herb-drug interactions: in vivo and in vitro effect of Shenmai injection, a herbal preparation, on the metabolic activities of hepatic cytochrome P450 3A1/2, 2C6,1A2, and 2E1 in rats[J]. Planta Med, 2010, 76(3): 245-250.

[4] 王奇，蘆柏震. 齊墩果酸的研究進(jìn)展[J]. 中國藥房，2008，19（9）：711-712.

[5] 王鵬，張忠義，吳忠. 熊果酸在藥用植物中的分布及藥理作用[J]. 中藥材，2000，23（11）：717-722.

[6] 王亞平，胡園，董瑞華，等. 齊墩果酸和熊果酸的人肝微粒體代謝研究[J]. 軍事醫(yī)學(xué)，2012， 36（5）：368-371.

[7] Bjornsson TD, Callaghan JT, Einolf HJ,et al. The conduct of in vitro and in vivo drug-drug interaction studies: a PhRMA perspective[J]. J Clin Pharmacol, 2003, 43(5): 443-469.

[8] Huang SM, Temple R, Throckmorton DC,et al. Drug interaction studies: study design, data analysis, and implications for dosing and labeling[J]. Clin Pharmacol Ther, 2007, 81(2): 298-304.

[9] Harris JW, Rahman A, Kim BR,et al. Metabolism of taxol by human hepatic microsomes and liver slices: participation of cytochrome P450 3A4 and an unknown P450 enzyme[J]. Cancer Res, 1994, 54(15): 4026-4035.

[10] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典（二部）[S]. 2010年版.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2010：537-538.

[11] 張江偉. 藥物代謝穩(wěn)定性和藥物相互作用的體外研究方法及其應(yīng)用[C]. 北京：中國科學(xué)院研究生院，2008：43-68.

[12] Seripa D, Pilotto A, Panza F,et al. Pharmacogenetics of cytochrome P450 (CYP) in the elderly[J]. Ageing Res Rev, 2010,9(4): 457-474.

[13] 劉丹，孟艷秋，趙娟. 齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)修飾物的藥理活性和構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)通報(bào)，2007，1：14-20.