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        同分異構(gòu)體齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP450酶抑制作用的差異

        2012-09-27 07:28:04王亞平董瑞華劉澤源劉皈陽(yáng)解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科北京0007河北北方學(xué)院河北張家口075000軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院臨床藥理室北京0007解放軍總醫(yī)院臨床藥理室北京0085
        關(guān)鍵詞:微粒體齊墩咪達(dá)唑侖

        王亞平,董瑞華,劉澤源,胡 園,劉皈陽(yáng)(. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科,北京 0007;2. 河北北方學(xué)院,河北 張家口 075000;. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院臨床藥理室,北京 0007;.解放軍總醫(yī)院臨床藥理室,北京 0085)

        細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族,在外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用。CYP450可受多種因素的影響,尤其是藥物,并引起自身或其他藥物的藥代動(dòng)力學(xué)改變,使得藥效增強(qiáng)(中毒)或減弱(無(wú)效),從而導(dǎo)致藥物-藥物相互作用[1]。

        近年來(lái)有關(guān)中藥活性成分對(duì)CYP450酶系影響的研究備受關(guān)注[2-3]。齊墩果酸和熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物,存在于多種藥用植物中,具有多種生物學(xué)活性,如保肝、抗炎、抗腫瘤、抗HIV等[4-5]。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,齊墩果酸不經(jīng)過(guò)CYP450酶代謝,而CYP450酶參與了熊果酸的代謝[6]。本文以此為基礎(chǔ),以人肝微粒體溫孵系統(tǒng)為模型,進(jìn)一步對(duì)比研究齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP450酶的抑制作用,為臨床合理用藥提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        Agilent 1100 高效液相色譜儀,包括G1311A 四元泵,G1316A 柱溫箱,G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器,G1379A在線脫氣機(jī),G1314A VWD 可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器,G1321A FLD 熒光檢測(cè)器和HP 色譜工作站;色譜柱Krosmail 100-5C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)購(gòu)自迪馬科技公司;高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司);電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

        齊墩果酸、熊果酸、非那西丁、雙氯芬酸鈉、右美沙芬氫溴酸鹽、氯唑沙宗、S-美芬妥英、香豆素、呋拉茶堿、8-甲氧補(bǔ)骨脂素、槲皮素、磺胺苯吡唑、奎尼丁、克拉霉素、氯美噻唑、D-葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)、氧化性輔酶Ⅱ(NADP+)均購(gòu)自Sigma公司;咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司);混合人肝微粒體(15例)(美國(guó)BD公司);其余試劑為色譜純或分析純。

        1.2 齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP亞型的抑制作用

        200 μL孵育體系包括磷酸鉀緩沖液(pH = 7.4,100 mmol·L-1);NADPH 生成體系(1 mmol·L-1NADP+,10 mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸,1 U·mL-1葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,4 mmol·L-1MgCl2);肝微粒體(0.5 mg·mL-1)和底物。

        在孵育體系加入NADPH生成體系前,加入CYP探針?biāo)幬锖妄R墩果酸或熊果酸 50 μmol·L-1,并以CYP探針?biāo)幬锏奶禺愋砸种苿┳鳛殛?yáng)性對(duì)照,考察齊墩果酸或熊果酸對(duì)CYP各亞型的抑制作用。8種CYP亞型探針底物及其濃度分別為:非那西丁(40 μmol·L-1,CYP1A2);香豆素(1.0 μmol·L-1, CYP2A6);紫杉醇(10 μmol·L-1, CYP2C8);雙氯芬酸(10 μmol·L-1,CYP2C9);右美沙芬(25 μmol·L-1,CYP2D6);氯唑沙宗(120 μmol·L-1,CYP2E1);咪達(dá)唑侖(10 μmol·L-1,CYP3A4);S-美芬妥英(10 μmol·L-1,CYP2C19)。CYP各亞型的抑制劑及其對(duì)應(yīng)的濃度分別為:呋拉茶堿(10 μmol·L-1,CYP1A2);8-甲氧補(bǔ)骨脂素(2.5 μmol·L-1,CYP2A6);槲皮素(20 μmol·L-1,CYP2C8);磺胺苯吡唑(10 μmol·L-1,CYP2C9);奎尼?。?0 μmol·L-1,CYP2D6);克拉霉素(10 μmol·L-1,CYP3A4);氯美噻唑(50 μmol·L-1,CYP2E1);奧美拉唑(10 μmol·L-1,CYP2C19)。37 ℃預(yù)孵育3 min后,加入NADPH生成體系起始反應(yīng),孵育一定時(shí)間后,加入100 μL甲醇或乙腈終止反應(yīng)。然后4 ℃,20 000×g離心10 min,取上清液20 μL進(jìn)行HPLC分析。呋拉茶堿、8-甲氧補(bǔ)骨脂素是基于機(jī)理的抑制劑[7-9],所以它與人肝微粒體、緩沖液和NADPH產(chǎn)生體系在37 ℃孵育20 min后,加入探針底物起始反應(yīng),后續(xù)操作同上。探針底物及其產(chǎn)物的檢測(cè)參考文獻(xiàn)[10-11],所有孵育樣品均做復(fù)管,結(jié)果取平均值。

        為確定齊墩果酸和熊果酸是否為CYP基于機(jī)理的抑制劑,進(jìn)行NADPH-時(shí)間依賴性的抑制實(shí)驗(yàn)。齊墩果酸或熊果酸(50 μmol·L-1)和NADPH產(chǎn)生體系、人肝微粒體孵育一定時(shí)間(0,5,10,15 min),加入相對(duì)應(yīng)的底物起始反應(yīng),并測(cè)定活性。

        1.3 齊墩果酸對(duì)CYP3A4抑制常數(shù)的測(cè)定

        固定人肝微粒體蛋白濃度為0.5 mg·mL-1,孵育時(shí)間為30 min,咪達(dá)唑侖的終濃度選擇10,25,50,100 μmol·L-1,作為抑制劑的齊墩果酸終濃度選擇10,25,50,100 μmol·L-1。

        使用Dixon作圖法和Lineweaver-Burk作圖法來(lái)確定抑制反應(yīng)的類型,以Lineweaver-Burk作圖所得斜率同齊墩果酸濃度的二次作圖求得齊墩果酸的抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)Ki。

        2 結(jié)果

        2.1 齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP亞型的抑制作用

        齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP450酶活性的抑制作用結(jié)果見圖1,在考察的8種CYP亞型當(dāng)中,齊墩果酸對(duì)CYP3A4的活性抑制作用最強(qiáng),抑制率接近50%,CYP1A2次之,對(duì)其他幾種酶的活性抑制率都在30%以下,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熊果酸對(duì)8種酶的活性抑制率均小于20%,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了測(cè)定齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP各個(gè)亞型基于機(jī)理抑制作用的活性,進(jìn)行了NADPH-時(shí)間依賴性的抑制試驗(yàn)。對(duì)所測(cè)定的CYP亞型,均沒有發(fā)現(xiàn)NADPH-時(shí)間依賴性的抑制表現(xiàn)。

        圖1 齊墩果酸和熊果酸對(duì)CYP450酶活性的抑制率Fig 1 The inhibition ratio of oleanolic acid and ursolic acid on cytochromes P450

        2.2 齊墩果酸對(duì)CYP3A4抑制常數(shù)的測(cè)定

        根據(jù)抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖1),齊墩果酸對(duì)CYP3A4酶的活性抑制超過(guò)了50%,因此我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)和抑制常數(shù)(Ki)。齊墩果酸對(duì)CYP3A4催化咪達(dá)唑侖羥化反應(yīng)的抑制程度隨濃度增加而增強(qiáng),在100 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi),其IC50值為(35.0±5.0) μmol·L-1(圖2)。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們進(jìn)行了不同濃度的齊墩果酸對(duì)不同濃度的咪達(dá)唑侖羥化反應(yīng)抑制效果的實(shí)驗(yàn),所得到的數(shù)據(jù)用Dixon 和Lineweaver-Burk 作圖處理(圖3和圖4)。由圖可知,齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖代謝的抑制符合混合動(dòng)力學(xué)行為,用Lineweaver-Burk作圖所得斜率與齊墩果酸濃度二次作圖求得齊墩果酸的抑制常數(shù)Ki為39.2 μmol·L-1(圖5)。

        圖2 齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖羥化活性的抑制Fig 2 Inhibition effect of oleanolic acid on midazolam hydroxylation activity

        圖3 齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖羥化活性抑制效應(yīng)的Dixon作圖Fig 3 Dixon plot of inhibitory effects of oleanolic acid on midazolam hydroxylation activity

        圖4 齊墩果酸對(duì)咪達(dá)唑侖羥化活性抑制效應(yīng)的Lineweaver-Burk 作圖Fig 4 Lineweaver-Burk plots of inhibitory effects of oleanolic acid on midazolam hydroxylation acticity

        圖5 Lineweaver-Burk作圖得到的斜率與齊墩果酸濃度的二次作圖Fig 5 Second plot of slopes from Lineweaver-Burk plot vs oleanolic acid concentrations

        3 討論

        本文對(duì)比研究了齊墩果酸和熊果酸對(duì)8種主要CYP亞型的抑制效果。初步篩選結(jié)果表明熊果酸對(duì)CYP450酶的活性沒有表現(xiàn)出明顯的抑制,齊墩果酸對(duì)CYP1A2的活性有輕微的抑制作用,對(duì)CYP3A4活性有明顯的抑制,在基于機(jī)理抑制的實(shí)驗(yàn)中,沒有觀察到NADPH-時(shí)間依賴性的抑制,排除了兩者對(duì)CYP基于機(jī)理抑制的可能性。我們進(jìn)一步研究齊墩果酸對(duì)CYP3A4酶的抑制常數(shù),發(fā)現(xiàn)齊墩果酸可競(jìng)爭(zhēng)性抑制CYP3A4探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖羥化反應(yīng)的活性,并測(cè)得抑制常數(shù)Ki為39.2 μmol·L-1。由于CYP3A4酶是人體內(nèi)一類非常重要的CYP代謝酶,臨床半數(shù)以上的藥物都要經(jīng)它代謝轉(zhuǎn)化[12],而且許多藥物也是它的誘導(dǎo)或抑制劑,所以齊墩果酸對(duì)CYP3A4酶的抑制作用應(yīng)引起我們的注意。

        鑒于齊墩果酸和熊果酸是同分異構(gòu)體,我們可以從結(jié)構(gòu)上推測(cè)導(dǎo)致兩者對(duì)CYP450酶抑制作用不同的原因。齊墩果酸和熊果酸的藥理活性基團(tuán),比如羥基、雙鍵和羧基的位置都一致[13],兩者的區(qū)別僅在于E環(huán)的甲基異構(gòu),齊墩果酸的E環(huán)上兩個(gè)甲基取代都在20位C上,而熊果酸的E環(huán)上19位和20位上各有一個(gè)甲基,結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以推測(cè)E環(huán)甲基取代位置可能是影響對(duì)CYP抑制效果的主要因素,至于結(jié)構(gòu)差異和抑制作用之間的關(guān)聯(lián)程度需要進(jìn)一步研究。

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