王曉霞，王穎超，趙 明

0 引 言

EPCs是一種在特定條件下可以分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，能形成新生血管，是血管修復(fù)中的關(guān)鍵細(xì)胞［1］。在糖尿病狀態(tài)下，活性氧的過度產(chǎn)生及氧化應(yīng)激水平提高致EPCs功能受損［2］。NO是EPCs動(dòng)員、分化及功能的主要調(diào)控者，活性氧能夠產(chǎn)生過多的超氧負(fù)離子O2－及過氧亞硝酸鹽，影響NO的生物利用度，降低了NO對(duì)EPCs的有利影響［3］。EPCs在缺血組織的新生血管方面及損傷血管的再內(nèi)皮化起重要的作用，因此EPCs完整性及功能活動(dòng)對(duì)于糖尿病血管病變起著至關(guān)重要的作用。高塘狀態(tài)下，活性氧過度產(chǎn)生，導(dǎo)致EPCs凋亡率增加，損傷內(nèi)皮細(xì)胞的完整性?？梢姡悄虿PCs凋亡率的增加是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［4］。SOD能夠中和超氧負(fù)離子O2－，EPCs通過提高SOD活性來增強(qiáng)抵御氧化應(yīng)激的能力［2］。GBE主要成分是黃酮類及內(nèi)酯類，具有抗氧化，清除氧自由基，抗衰老等作用。本研究通過GBE干預(yù)體外培養(yǎng)的EPCs，觀察其對(duì)EPCs凋亡、SOD活性的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 健康成人外周血15份(20 ml/份)為對(duì)照組，糖尿病外周血25份(20 ml/份)為實(shí)驗(yàn)組。入選標(biāo)準(zhǔn):年齡＞30歲、不吸煙的體檢正常者及糖尿病患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①吸煙;②近期外傷及手術(shù);③長(zhǎng)期使用維生素C、維生素E等抗氧化劑、降血脂類藥物、非甾體類抗炎藥、激素或免疫抑制劑影響氧化應(yīng)激狀態(tài)的藥物;④合并有冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、腦血管疾病、糖尿病大血管并發(fā)癥及糖尿病腎病、視網(wǎng)膜等微血管并發(fā)癥等影響EPCs的因素。

1.2 試劑 人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-paque購自天津?yàn)蠊?，M199培養(yǎng)基、胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，纖維連接蛋白為R＆D公司產(chǎn)品，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascularendothelialgrowth factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulinlike growth factors-1，IGF-1)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)為 Peprotech產(chǎn)品，F(xiàn)ITCUEA-I、Dil-Ac-LDL為 Sigma公司產(chǎn)品，4%多聚甲醛、胰蛋白酶購自北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司，實(shí)驗(yàn)耗材購自南京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，GBE購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，SOD檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EPCs分離 取成人外周血 20 ml，0.2 ml肝素鈉抗凝，PBS對(duì)倍稀釋，按1∶2加入人淋巴細(xì)胞分離液和稀釋的外周血［5］，2500r/min 離心30min，離心半徑12cm，小心吸取中間白膜層單個(gè)核細(xì)胞，加入2ml等滲鹽水適當(dāng)稀釋，2500r/min離心5min。

1.3.2 誘導(dǎo)分化 纖維連接蛋白按說明溶解稀釋，配制為 1 μg/ml，包被 24 孔板，每孔 200 μl，37℃ 孵育過夜，臨用前吸出多余液體。將分離的單個(gè)核細(xì)胞按(1～2)×106/ml接種于包被好的24孔板中，每份標(biāo)本接種12孔，每孔加入含20%胎牛血清，VEGF10 ng/ml，bFGF 2 ng/ml，IGF 2 ng/ml，EGF 10 ng/ml［5］，青霉素及鏈霉素各 0.5 μl的 M199 培養(yǎng)基0.5 ml。放入含5%CO2的37℃孵育箱中培養(yǎng)，間隔1d，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，換液，以后每4d換液1次。EPCs形態(tài)學(xué)變化見圖1。

1.3.3 EPCs鑒定 用添加血清和上述各種細(xì)胞因子的M199培養(yǎng)基在6孔板中按上述方法培養(yǎng)外周血中分離的單個(gè)核細(xì)胞爬片7 d，取出細(xì)胞爬片，用單純的 M199培養(yǎng)液洗2次，加入 Dil-Ac-LDL(10 μg/ml)37℃ 避光孵育貼壁細(xì)胞 4 h，單純的M199培養(yǎng)液洗3次后，用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，固定后用 PBS洗3次。FITC-UEA-I(10 μg/ml)加入上述標(biāo)本于37℃避光孵育貼壁細(xì)胞1h，PBS洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察，吞噬Dil-Ac-LDL呈現(xiàn)紅光，F(xiàn)ITC-UEA-I呈現(xiàn)綠光，染色雙陽性細(xì)胞呈黃色鑒定為 EPCs［6］。見圖 2。

1.3.4 SOD活性檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)第7天換液，添加含濃度分別為0 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L GBE培養(yǎng)基［7］，每組濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)24h后，提取細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒上的說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 EPCs凋亡檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)第7天換液，添加含濃度分別為 0 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L GBE培養(yǎng)基，每組濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)24h后，收集細(xì)胞上清液，每孔加入40 μl胰酶消化3～5 min，加入160μl血清吹打，收集EPCs用PBS洗2次后重懸于結(jié)合液中，依次加入5μlAnnexinV-FITC4℃孵育15min和10μl PI 4℃孵育5min，流式檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 分光光度計(jì)檢測(cè)不同濃度GBE干預(yù)EPCs 24 h后的SOD活性 實(shí)驗(yàn)組中，10 mg/L能夠提高EPCs SOD活性但無明顯差異(P＞0.05)，25 mg/L GBE及50 mg/LGBE明顯提高EPCs SOD活性(P＜0.05)，且隨GBE濃度增高效果愈明顯，對(duì)照組中，各濃度GBE提高EPCs SOD活性，但改變不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表1。

表1 分光光度計(jì)檢測(cè)不同濃度GBE干預(yù)EPCs 24 h后的SOD活性Table 1 SOD activity of EPCs after 24 h GBE intervention at 0，10，25 and 50 mg/L by spectrophotometry

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度GBE干預(yù)EPCs 24 h后的凋亡率 實(shí)驗(yàn)組中，EPCs凋亡率隨GBE濃度增高而降低(P＜0.05)，50 mg/L GBE降低EPCs凋亡率最顯著(P＜0.01);對(duì)照組中，各濃度 GBE降低EPCs凋亡率，但改變不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表2，圖3。

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度GBE干預(yù)EPCs 24 h后的凋亡率(%)Table 2 Apoptosis of EPCs after 24 h GBE intervention at 0，10，25 and 50 mg/L by fluorescence-activated cell sorting(%)

圖1 EPCs的形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 Morphological changes of EPCs at different times of culture

圖2 EPCs的鑒定圖片F(xiàn)igure 2 Identifcation of EPCs

圖3 AnnexinV-FITC/PI染色和流式細(xì)胞儀分析EPCs凋亡圖Figure 3 Apoptosis of EPCs by AnnexinV-FITC/PI dyeing and fluorescence-activated cell sorting

3 討 論

EPCs是具有遷移、增殖、黏附和分化成內(nèi)皮細(xì)胞功能的前體細(xì)胞，不僅參與胚胎期血管的形成，也參與成人新生血管的發(fā)生［8］。EPCs數(shù)目及功能與內(nèi)皮功能及血管再生正相關(guān)，而與心血管危險(xiǎn)因素負(fù)相關(guān)。EPCs數(shù)目減少是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率和死亡率的預(yù)警信號(hào)［9］。糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)展過程中，除了年齡這一影響因素，缺少EPCs依賴的動(dòng)脈修補(bǔ)是主要原因之一?；谶z傳學(xué)的分子證據(jù)顯示動(dòng)脈粥樣硬化損傷最開始的形式是動(dòng)脈修補(bǔ)不足而非動(dòng)脈損傷［10］。因此，糖尿病時(shí)動(dòng)脈損傷超過EPCs的修補(bǔ)能力而達(dá)到一種新的動(dòng)態(tài)平衡，尤其當(dāng)EPCs的凋亡率不斷增加的情況下，EPCs動(dòng)脈修補(bǔ)功能幾近耗竭。另外，EPCs凋亡導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增加，血細(xì)胞黏附到血管壁，粥樣斑塊剝脫及隨后的血栓形成［11］，直接導(dǎo)致糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)展。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病及其并發(fā)癥最重要的發(fā)病機(jī)制之一，骨髓來源的EPCs在血管生成及歸巢到外周血中對(duì)傷口愈合起關(guān)鍵作用，內(nèi)皮細(xì)胞氮氧化物合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)及磷酸化作用對(duì)于EPCs的存活、遷移、血管發(fā)生至關(guān)重要。正常情況下，eNOS以精氨酸為底物，在四氫生物蝶呤(BH4)輔助下合成NO，但氧化應(yīng)激狀態(tài)下，BH4被氧化，eNOS解偶聯(lián)失活，使EPCs從骨髓動(dòng)員至外周血減少［12－13］。燕建軍等［7］發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是重要的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子，高糖狀態(tài)下細(xì)胞代謝加劇，甚至代謝紊亂，使細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧自由基(ROS)水平升高，谷胱甘肽氧化還原循環(huán)障礙，細(xì)胞清除氧自由基能力下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GBE降低高糖條件下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與清除氧自由基，抗氧化以及影響糖代謝的作用密切相關(guān)。與上述結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度GBE干預(yù)體外培養(yǎng)的EPCs，因GBE抗氧化特性，使EPCs SOD活性提高，凋亡率下降，且呈劑量依賴性?？梢?，活性氧在糖尿病中扮演了重要角色，EPCs凋亡率的增加、SOD活性的改變與糖尿病時(shí)炎性因子、氧化應(yīng)激水平的不斷提高有關(guān)［14］。另有研究表明，胰島素治療糖尿病時(shí)，能夠增加EPCs的NO產(chǎn)量，但不改變產(chǎn)量及形成集落的能力，然而，聯(lián)合使用SOD及胰島素治療，則明顯改善上述情況。Hamed等［15］研究數(shù)據(jù)顯示，SOD在EPCs中顯示一個(gè)必不可少的作用，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了在糖尿病中應(yīng)用抗氧化治療的重要性。

來源于骨髓的EPCs在內(nèi)皮細(xì)胞的管理和保護(hù)上面起到了一個(gè)完整的作用，同樣在血管形成方面，外周循環(huán)EPCs數(shù)目及功能對(duì)于大多數(shù)疾病而言，是血管損傷的有力標(biāo)記，這一標(biāo)記獨(dú)立于傳統(tǒng)或非傳統(tǒng)的致病因素［如:高血壓、高膽固醇血癥及C-反應(yīng)蛋白(c-reactive protein，CRP)］。有研究表明，在小鼠體內(nèi)注入外源性EPCs，通過減少致病因素、恢復(fù)缺血組織的修復(fù)提高內(nèi)皮功能，顯示潛在的血管修復(fù)能力［16］?；谶@一細(xì)胞治療，自體同源的EPCs作為一個(gè)新的治療方案用于糖尿病患者的血管重建及血管修復(fù)，然而，用于細(xì)胞移植的EPCs保留了體內(nèi)功能障礙特性，影響了這種方案的可行性。同時(shí)，糖尿病患者體內(nèi)的血管致病因素是可變的，臨床條件下，單純的通過EPCs數(shù)目及功能變化并不能充分反映血管疾病的進(jìn)展，因?yàn)檫@些變化同樣存在外膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞這類血管相關(guān)控制因素［17］。因此，EPCs治療糖尿病時(shí)，可能需要聯(lián)合戰(zhàn)略，通過調(diào)整周圍細(xì)胞的功能來影響EPCs，以達(dá)到最佳優(yōu)化治療方案，至于各種細(xì)胞如何相互影響、相互制約的關(guān)系是復(fù)雜的，受多種因素影響，這個(gè)問題至今尚未完全闡述清楚，需進(jìn)一步研究。

［1］Fadini GP，Avogaro A.Potential manipulation of endothelial progenitor cells in diabetes and its complications［J］.Diabetes Obes Metab，2010，12(7):570-583.

［2］Galasso G，Schiekofer S，Sato K，et al.Impaired angiogenesis in glutathione peroxidase-1-deficient mice is associated endothelial progenitor cell dysfunction［J］.Circ Res，2006，98(2):254-261.

［3］Thum T，Thum S，Daiber A，et al.Differential Effects of Organic Nitrates on Endothelial Progenitor Cells Are Determined by Oxidative Stress［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(4)，748-754.

［4］Zhang LJ，Liu WX，Chen YD.Proliferation，migration and apoptosis activities of endothelial progenitor cells in acute coronary syndrome［J］.Chin Med J(Engl)，2010，123(19):2656-2661.

［5］劉澤灝，雷閩湘，王愛民，等.成人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分離和誘導(dǎo)分化［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，30(5):566-569.

［6］Churdchomjan W，Kheolamai P，Manochantr S，et al.Comparison of endothelial progenitor cell function in type 2 diabetes with good and poor glycemic control［J］.BMC Endocr Disord，2010，10:5.

［7］燕建軍，彭輝燦，王俞方，等.銀杏葉提取物對(duì)高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響［J］.國(guó)際眼科雜志，2008，8(12):2417-2420.

［8］周 鑫，夏欣一，黃宇烽.循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的檢測(cè)及其在腫瘤臨床中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23(5):543-546.

［9］Foresta C，De Toni L，F(xiàn)erlin A，et al.Clinical implication of endothelial progenitor cells［J］.Expert Rev Mol Diaqn，2010，10(1):89-105.

［10］Seo DM，Wang L，Liu ZJ，et al.Inflammation，stem cells and atherosclerosis genetics［J］.Curr Opin Mol Ther，2010，12(6):712-723.

［11］Dernbach E，Urbich C，Brandes RP，et al.Antioxidative stressassociated genes in circulating progenitor cells:evidence for enhanced resistance against oxidative stress［J］.Blood，2004，104(12):3591-3597.

［12］吳雪暉，羅 飛，何清義.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21(9):981-985.

［13］趙 明.糖尿病下肢血管病變與血管重建［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23(12):1233-1235.

［14］George J，Goldstein E，Abashidze S，et al.Circulating endothelial progenitor cells in patients with unstable angina:association with systemic inflammation［J］.Eur Heart J，2004，25(12):1003-1008.

［15］Hamed S，Brenner B，Aharon A.Nitric oxide and superoxide dismutase modulate endothelial progenitor cell function in type 2 diabetes mellitus［J］.Cardiovasc Diabetol，2009，8:56.

［16］Jarajapu YP，Grant MB.The promise of cell-based therapies for diabetic complications:challenges and solutions［J］.Circ Res，2010，106(5):854-869.

［17］Sen S，McDonald SP，Coates PT，et al.Endothelial progenitor cells:novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease［J］.Clin Sci(Lond)，2011，120(7):263-283.