李海龍 （北京市昌平區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 102200）

萬宇平* 馮才茂 孫 震 崔廷婷 （北京勤邦生物技術有限公司）

磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，現(xiàn)廣泛用于預防和治療乳牛傳染病[1]，并有飼料生產(chǎn)企業(yè)將其作為飼料添加劑，以預防病毒性疾病的發(fā)生，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進奶牛的生長及生產(chǎn)性能[2]。但不合理的使用容易造成藥物在牛奶中的殘留，并對人體健康產(chǎn)生危害，如引起過敏反應、增加細菌耐藥性等[3,4]。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中已規(guī)定牛奶中總磺胺以及單個磺胺藥物的最高殘留限量(MRL)為100μg/kg，磺胺二甲嘧啶的MRL為25μg/kg[5]，建立快速、靈敏、準確的磺胺類藥物殘留檢測技術非常必要。

膠體金免疫層析技術(Gold immunochromatographic assay，GICA)是近年來發(fā)展迅速的一項免疫標記技術，它以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎、大孔徑微孔濾膜為載體、膠體金為固相標記物來定性檢測樣本中的待測物質(zhì)[6]。因其快速、便捷，因此繼抗生素微生物檢測法[7,8]、理化分析法(高效液相色譜法[1,9]、液質(zhì)聯(lián)用法[10,11]、氣相色譜法[12]、分光光度法[13]等)和免疫測定法(酶聯(lián)免疫法[14]、放射免疫法[15]等)后，GICA分析法逐漸被廣泛應用于牛奶中抗生素殘留檢測中[6,16,17]。本試驗利用膠體金免疫層析法對牛奶中的磺胺類藥物殘留進行檢測，為磺胺類藥物的殘留監(jiān)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）市售牛奶、磺胺類藥物快速檢測試紙(北京勤邦生物技術有限公司)其中包括微孔試劑和試紙條、磺胺類藥物標準品(美國Sigma公司)純度≥99%。（2）微量移液器(單道20～200μl、100～1000μl、多道50～300μl美國Thermo公司)、Acquity液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源(美國Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 使用前將待檢奶樣恢復至室溫。(注：牛奶樣品必須為均勻液體，不能有結(jié)塊、發(fā)酸和沉淀)。

1.2.2 檢測步驟 將原包裝預先平衡至室溫，打開后取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙條，并做好標記；用微量移液器吸取200μl待檢牛奶樣品溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；將標記好的試紙條插入微孔中印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中；室溫(20～25℃)孵育5min后，取出試紙條，判定結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判斷 陰性(-)：C線和T線都顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣品中磺胺類藥物濃度低于檢測限。陽性(+)：C線顯色，T線不顯色，表示牛奶樣品中磺胺類藥物濃度高于或等于檢測限。無效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)失效。在此情況下，應用新的試紙重新測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度試驗

采用樣品前處理方法，在空白樣品中分別添加磺胺類藥物標準品至一定的終濃度，然后取三批試紙條進行檢測，每批測定5個重復，結(jié)果見表1，部分實驗結(jié)果見圖1。

由表1可知，磺胺類藥物快速檢測試紙條測定牛奶中磺胺類藥物殘留的檢測限分別為：磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯噠嗪30μg/L、磺胺間二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺間甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺對甲氧嘧啶30μg/L、磺胺異噁唑10μg/L、磺胺甲氧噠嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L。

表1 靈敏度試驗 (mg/L)

圖1 試紙條檢測限實驗結(jié)果

2.2 假陽性率試驗

用3個批次的磺胺類藥物膠體金試紙條對50份陰性牛奶樣品進行檢測，結(jié)果見表2。該50份陰性牛奶樣品中有1份為陽性，其余全為陰性，假陽性率為2%。

2.3 假陰性率試驗

用3個批次的磺胺類藥物膠體金試紙條對50份分別添加磺胺嘧啶至濃度60μg/L，磺胺二甲基嘧啶至濃度20μg/L，磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑至濃度80μg/L，磺胺氯噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶至濃度30μg/L，磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺苯酰至濃度50μg/L，磺胺異噁唑至濃度10μg/L、磺胺甲氧噠嗪、磺胺多辛至濃度70μg/L的陽性牛奶樣品進行檢測，結(jié)果見表2。該50份陽性牛奶樣品的檢測結(jié)果均為陽性，假陰性率為0。

2.4 特異性試驗

將恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素溶于pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，配成濃度為500μg/L的溶液，用試紙條進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C線和T線均顯色，顯示陰性結(jié)果，表明本試紙條對其他抗生素無交叉反應，具有較好的特異性。

表2 假陽性率、假陰性率試驗

2.5 與儀器方法比較

隨機抽取50份牛奶樣本，用試紙條方法和國標方法《GB/T 21316—2007 動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》分別進行檢測。結(jié)果篩選出3份陽性樣本，試紙條結(jié)果均為C線顯示出紅色條帶，T線不顯色；儀器結(jié)果分別為105.2μg/L、180.7μg/L和110.3μg/L?？梢姡珿ICA法和LC-MS/MS法測定結(jié)果基本一致，符合度達到100%，適用于牛奶樣本中磺胺類藥物殘留的檢測。

3 結(jié)論

本研究采用膠體金免疫層析法對牛奶中的磺胺類藥物殘留進行檢測，檢測限分別為磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯噠嗪30μg/L、磺胺間二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺間甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺對甲氧嘧啶30μg/L、磺胺異噁唑10μg/L、磺胺甲氧噠嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L，檢測陰、陽性樣本時，假陽性率為2%，假陰性率為0；對其他抗生素無交叉反應，特異性較好；與液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法相比，檢測結(jié)果一致，符合度達到100%。

本研究所使用的膠體金試紙條是在傳統(tǒng)的試紙條基礎上進行了改進。將膠體金標記的抗體直接凍干在微孔試劑中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應，從而減少誤差，增加整個體系的反應靈敏度，易于對樣品中的藥物殘留情況進行分析；同時，擯棄了傳統(tǒng)試紙條的塑料卡殼，僅以“裸條”形式裝于試劑桶中，節(jié)約空間，減少生產(chǎn)和運輸成本。盡管結(jié)構(gòu)的改進提高了試紙條的靈敏度，但由于通過顏色判斷結(jié)果比較主觀，可能出現(xiàn)假陽性問題，因此對于陽性樣本，還需要用LC-MS/MS等儀器方法進行確證。

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