胡莉娟

我國銀杏資源占世界銀杏資源的3／4以上，是世界上最大的銀杏生產(chǎn)國，但在銀杏葉的開發(fā)利用研究上落后于一些發(fā)達(dá)國家，而且存在產(chǎn)品收率低、產(chǎn)品質(zhì)量差等問題，造成了國有資源的極大浪費(fèi)。因此，致力于這一領(lǐng)域的研究和開發(fā)，對現(xiàn)有工藝進(jìn)行優(yōu)化和改造，提高產(chǎn)品的收率和產(chǎn)品的質(zhì)量，是一項(xiàng)長期堅持的任務(wù)，對促進(jìn)我國的科技進(jìn)步，提高產(chǎn)品的競爭力和經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著極其重要的意義。銀杏葉提取物藥理作用很廣泛，發(fā)揮藥理作用的是其中的主要成分黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯，經(jīng)研究表明，黃酮醇苷能有效地消除體內(nèi)有毒的過氧自由基的作用，具有降低血脂、促進(jìn)血液循環(huán)及腦部代謝；萜類內(nèi)酯除具有擴(kuò)張冠狀動脈血管、增加血流量、改善腦營養(yǎng)和抗菌作用外，還具有較強(qiáng)的血小板活化因子抑制作用，臨床應(yīng)用也很廣泛。多年來，針對各有效部位或有效單體成分開發(fā)的新藥還比校少，本試驗(yàn)采用閃式硅膠柱層析法實(shí)現(xiàn)了銀杏黃酮與萜類內(nèi)酯的快速有效分離，為進(jìn)一步根據(jù)其性質(zhì)特點(diǎn)進(jìn)行有針對性的分離純化工作奠定了基礎(chǔ)。針對其有效部位或有效成分單獨(dú)開展研究，將使其藥理作用和臨床應(yīng)用更有針對性，這樣必將使其能更好的應(yīng)用于臨床，為人類健康做出更大的貢獻(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters1525液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器，Waters2420蒸發(fā)散射光檢測器，Empower project色譜工作站，SZ－93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑 槲皮素、山柰素、異鼠李素、白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C對照品（批號分別為100081－200406、110861－200405、110865－200404、110862－200305、110863－200505、110864－200304、110863－200307，定量測定用）均購自中國藥品生物制品檢定所，甲醇等為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)材料

供試品上閃式硅膠柱前銀杏葉提取物的制備：取銀杏葉l kg，粉碎，用50%的乙醇回流提取，回流液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至適量，加水溶散，濾過，上AB－8大孔樹脂柱，水洗澄清后，再用4倍床體積10%乙醇洗脫，然后用8倍床體積70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，濃縮成稠浸膏，加閃式層析硅膠適量拌勻，真空干燥，即得。

2 試驗(yàn)方法

2.1 閃式硅膠柱分離純化總黃酮醇苷條件優(yōu)選

2.1.1 試驗(yàn)方法 取上述硅膠拌勻干燥后的銀杏葉提取物適量加于閃式硅膠柱（Φ20mm×300 mm，填料高180mm，濕法裝柱）上，分別用乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇洗脫，收集洗脫液，每一倍床體積為1份（每種溶劑收集5份），共20份。采用高效液相色譜法分別測定每份洗脫液中總黃酮醇苷含量。

2.1.2 總黃酮醇苷的含量測定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（46mm×250mm，5um）；甲醇－0.4%磷酸溶液（50∶50）為流動相；檢測波長為360nm。2.1.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品，加甲醇制成每1ml分別含0.255 2、0.250 0、0.069 2mg／ml的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密吸取每份洗脫液100ml，蒸干，殘渣加甲醇－25%鹽酸溶液（4：1）混合液25ml溶解，移入250ml燒瓶中，回流30min，冷卻，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液5μl，供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，分別計算三種黃酮醇苷元的含量，按下式核算成總黃酮醇苷的含量（表1）。

總黃酮醇苷含量＝（槲皮素含量＋山柰素含量＋異鼠李素含量）×2.51

表1 四種洗脫劑對總黃酮苷洗脫量的比較

2.1.6 結(jié)果 銀杏葉總黃酮醇苷不易被乙酸乙酯洗脫，以丙酮為洗脫劑時，總黃酮醇苷基本洗脫完全，所得產(chǎn)物純度較高，總黃酮醇苷回收率也較高，故選擇丙酮作為洗脫劑，同時根據(jù)洗脫曲線定丙酮洗脫用量為4倍床體積。

2.2 閃式硅膠柱分離純化萜類內(nèi)酯條件優(yōu)選

2.2.1 試驗(yàn)方法 同上述總黃酮醇苷洗脫方法，收集洗脫液，每1倍床體積為1份（預(yù)試驗(yàn)顯示萜類內(nèi)酯較易洗脫，故每種溶劑收集洗脫液3份），共12份。采用高效液相色譜法分別測定每份洗脫液中萜類內(nèi)酯含量。

2.2.2 萜類內(nèi)酯的測定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（46mm×250mm，5μm）；甲醇一四氫呋喃一水（25∶10∶65）為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。2.2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過夜的白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C對照品，加甲醇制成每1ml分別含1.038、l.035、0.537、0.590mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密吸取樣品100 ml，蒸干，加水10ml超聲溶散，移入分液漏斗中，滴加2%鹽酸2滴，用乙酸乙酯提取4次（15、10、10、10ml），合并提取液，用5%乙酸鈉溶液20 ml洗滌，分取乙酸鈉液，再用乙酸乙酯10ml洗滌。合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗滌2次，每次20ml，合并水洗液，用乙酸乙酯10ml洗滌，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容于5ml量瓶中，搖勻，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.2.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液5μl、10μl，供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計算樣品中萜類內(nèi)酯的含量（表2）。

表2 三種洗脫劑對萜類內(nèi)酯洗脫量的比較

2.2.6 結(jié)果 銀杏葉萜類內(nèi)酯易被乙醚、乙酸乙酯洗脫，但乙醚易揮發(fā)而且不安全，故選用乙酸乙酯為洗脫劑，根據(jù)洗脫曲線定乙酸乙酯洗脫用量為3倍床體積。

3 驗(yàn)證與結(jié)論

取上述大孔樹脂所得樣品適量。平分兩份。加硅膠拌勻，干燥后加于閃式硅膠柱（Φ20mm×300mm，填料高180mm，濕法裝柱）上，先用乙酸乙酯3倍床體積洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，殘渣用甲醇溶解并定容于25ml量瓶中，搖勻；再用丙酮4倍床體積洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，浸膏用水定容至25ml量瓶中，搖勻。采用高效液相法分別測定萜類內(nèi)酯、總黃酮醇苷含量（萜類內(nèi)酯含量測定供試品溶液的制備：取上述甲醇定容液5ml蒸干，然后同上法處理。總黃酮醇苷含量測定供試品溶液的制備：取上述水定液，蒸干，然后同上法處理。其它測定條件同上）

表3 閃式硅膠柱層析驗(yàn)證

由表3結(jié)果可知，用閃式硅膠柱層析將銀杏黃酮與萜類內(nèi)酯分開的同時，二者的損失均很小，故此工藝合理可行，可進(jìn)行放大。

4 討論

銀杏葉提取物藥理作用很廣泛，臨床應(yīng)用也很廣泛，這與其中藥效成分的復(fù)雜性有關(guān)。多年來，銀杏葉提取物的藥理藥效研究和臨床應(yīng)用大多是含銀杏黃酮和萜類內(nèi)酯的提取物，針對各有效部位或有效單體成分開發(fā)的新藥還比較少，本試驗(yàn)采用閃式硅膠柱層析法實(shí)現(xiàn)了銀杏黃酮與萜類內(nèi)酯的快速有效分離，為進(jìn)一步根據(jù)其性質(zhì)特點(diǎn)進(jìn)行有針對性的分離純化工作奠定了基礎(chǔ)。針對其有效部位或有效成分單獨(dú)開展研究，將使其藥理作用和臨床應(yīng)用更有針對性，這樣必將使其能更好的應(yīng)用于臨床，為人類健康做出更大的貢獻(xiàn)。

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