周 鋒 偉, 姜 照 祥, 付 紹 平, 朱 靖 博

( 大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

西洋參(PanaxquinquefoliumL.)又稱花旗參、洋參、西洋人參,味苦、性涼、入心、肺、腎經(jīng)[1],為五加科(Araliaceae)人參屬多年生草本植物,原產(chǎn)于美國東部和加拿大,目前我國已有大面積栽培。西洋參具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰,清火生津的功效。其性偏于寒涼,對氣虛而陰津耗傷有熱者最為適宜[2-3]。

人參皂苷是西洋參中的主要活性物質(zhì)[4-5]。迄今為止,中外學(xué)者已從西洋參中分離鑒定出的皂苷類成分的苷元有3種:達(dá)瑪烷型(Dammarane)、齊墩果烷型(Oleanane)、奧克梯隆醇型(Ocotillol);而分離出的人參皂苷單體化合物近50種。對于西洋參中高純度單體皂苷制備已有報道[6-7],其中以色譜法分離效果最佳,分離填料的選擇多集中在大孔樹脂、葡聚糖凝膠、硅膠等[8-9]。本文首次采用正相硅膠色譜柱和反相SG-64色譜柱相結(jié)合的方法,僅通過兩次柱色譜分離就從西洋參總皂苷中分離得到6個純度超過95%的單體人參皂苷類物質(zhì)。此方法成本低、效率高、操作簡便。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

西洋參總皂苷粉,沈陽藥科大學(xué)提供；薄層層析硅膠,青島海洋化工有限公司；薄層色譜硅膠預(yù)制板GF254,煙臺化學(xué)工業(yè)研究所；反相填料SG-64,購自美國羅門哈斯公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申生科技有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀,美國DIONEX公司；Finnigan MAT LCQTMESI接口的離子阱質(zhì)譜儀,美國Finnigan公司。

1.2 方 法

1.2.1 西洋參總皂苷的初分離

稱取西洋參總皂苷粉130 g,用適量的甲醇溶解,加入200～300目硅膠390 g,水浴蒸干,過程中不斷攪拌,用研缽將其研成粉末,待用。取薄層層析硅膠2.6 kg作為分離膠,用漏斗慢慢裝入到玻璃柱內(nèi),使其鋪放均勻(其間要用真空泵把硅膠抽實(shí)),在其上用漏斗裝入樣品膠,最上層放置濾紙,然后用洗脫液洗脫。首先用純氯仿平衡柱子,然后按照V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5,9∶1,…,0.5∶9.5進(jìn)行梯度洗脫(洗脫液中加千分之一的水),TLC和HPLC檢測分離結(jié)果。將具有相同物質(zhì)的組分合并。

1.2.2 初分物的二次分離

將“1.2.1”得到的粗品組分溶解于10%甲醇水中,上反相SG-64色譜柱,甲醇-水梯度洗脫(10%～100%),HPLC跟蹤檢測,合并單體皂苷物質(zhì),減壓濃縮至干。

1.2.3 薄層層析法

用氯仿-甲醇-水[V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶35∶10]作展開劑,用碘蒸汽進(jìn)行顯色。每組餾分進(jìn)行薄層檢測,根據(jù)Rf值,合并具有相同物質(zhì)的餾分。

1.2.4 液相色譜分析

色譜柱,Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)；體積流量,1.00 mL/min；檢測波長,203 nm；柱溫,室溫；進(jìn)樣量,20 μL。采用二元梯度洗脫,流動相為乙腈和水。洗脫比例:乙腈體積分?jǐn)?shù)10%(0 min)→20%(5 min)→35%(20 min)→35%(30 min)→43%(45 min)→43%(52 min)→58%(67 min)→75%(72 min)→75%(75 min)。

1.2.5 質(zhì)譜檢測條件

m/z掃描范圍,100～1 500 U；干燥氣溫度,325 ℃ ；干燥氣體積流量,10.0 L/min；霧化氣壓力,27.6 Pa；離子化方式,ESI(+)和ESI(-)；電噴霧電壓,3 500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的分離

采用正相硅膠真空柱分離,共收集150瓶(2 L/瓶)。根據(jù)TLC檢測,合并Rf值相同點(diǎn)的餾分溶液,得到了11組餾分。最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,蒸干得到固體產(chǎn)物。

稱取9.5 g的初分得到的餾分5的干物質(zhì),將其溶解于10%的甲醇水中,上于反相SG-64柱(6 cm×60 cm),體積流量70 mL/min,流動相依次以10%～100%甲醇水進(jìn)行梯度洗脫,HPLC檢測分離結(jié)果。合并具有相同物質(zhì)的餾分,得到化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ見圖1。

稱取12.5 g的初分得到的餾分7的干物質(zhì),將其溶解于10%的甲醇水中,上于反相SG-64柱(6 cm×60 cm),體積流量70 mL/min,流動相依次以10%～100%甲醇水進(jìn)行梯度洗脫,HPLC檢測分離結(jié)果。合并具有相同物質(zhì)的餾分,得到化合物Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ見圖1。

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性,Molish反應(yīng)陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖2可知,(-)ESI-MSm/z:846.6[M+HCOO]-,800.4[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:802.5[M+H]+,640.8[M-Glc+H]+,622.3[M-Glc-H2O+H]+,459.7[M-2Glc-H2O+H]+,441.9[M-2Glc-2H2O+H]+,423.8[M-2Glc-3H2O+H]+。通過圖2、3可以發(fā)現(xiàn)化合物Ⅰ與化合物Ⅱ的分子質(zhì)量一樣,與文獻(xiàn)[5]報道中的人參皂苷Rg1和La一致,通過對比化合物在液相色譜上的保留時間可以發(fā)現(xiàn),化合物Ⅱ的保留時間大于化合物Ⅰ,故鑒定化合物Ⅰ為人參皂苷Rg1。

化合物Ⅱ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性,Molish反應(yīng)陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖3可知,(-)ESI-MSm/z:846.3[M+HCOO]-,800.4[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:802.5[M+H]+,622.3[M-Glc-H2O+H]+。通過與文獻(xiàn)[5]對比,鑒定該物質(zhì)為化合物Ⅰ的同分異構(gòu)體人參皂苷La。

化合物Ⅲ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性,Molish反應(yīng)陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖4可知,(-)ESI-MSm/z:830.4[M+HCOO]-,784.3[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:768.4[M-H2O+H]+,750.4[M-2H2O+H]+,622.0[M-Rha-H2O+H]+,441.9[M-Rha-Glc-2H2O+H]+,423.8[M-Rha-Glc-2H2O+H]+,405.8[M-Rha-Glc-2H2O+H]+。通過參考文獻(xiàn)[5]鑒定該化合物為人參皂苷Rg2。

圖1 化合物Ⅰ～Ⅵ的高效液相色譜分析結(jié)果

圖2 化合物Ⅰ的質(zhì)譜圖

圖3 化合物Ⅱ的質(zhì)譜圖

圖4 化合物Ⅲ的質(zhì)譜圖

化合物Ⅳ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性,Molish反應(yīng)陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖5可知,(-)ESI-MSm/z:992.8[M+HCOO]-,946.7[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:769.1[M-Glc-H2O+H]+,588.1[M-2Glc-2H2O+H]+。通過參考文獻(xiàn)[6]鑒定該物質(zhì)人參皂苷Re。

化合物Ⅴ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性,Molish反應(yīng)陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖6可知,(-)ESI-MSm/z:846.2[M+HCOO]-,800.6[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:783.8[M-H2O+H]+,638.2[M-Rha-H2O+H]+,碎片439、421是人參皂苷P-F11在正離子模式下的特征碎片。鑒定該物質(zhì)為擬人參皂苷P-F11。

圖5 化合物Ⅳ的質(zhì)譜圖

圖6 化合物Ⅴ的質(zhì)譜圖

化合物Ⅵ:白色粉末(甲醇),溶于甲醇、乙醇,微溶于甲醇水,不溶于丙酮、乙酸乙酯。鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性,Molish反應(yīng)陽性,薄層酸水解檢出葡萄糖。由圖7可知,(-)ESI-MSm/z:992.9[M+HCOO]-,946.7[M-H]-；(+)ESI-MSm/z:768.2[M-Glc- H2O+H]+,750.3[M-Glc-2H2O+H]+,以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道一致,因此,可鑒定該化合物為人參皂苷Rd。

圖7 化合物Ⅵ的質(zhì)譜圖

3 結(jié) 論

本文采用硅膠柱層析與反相SG-64柱層析相結(jié)合的方式,對西洋參中的人參皂苷類物質(zhì)進(jìn)行分離。通過兩次柱層析得到了6個單體化合物,通過HPLC檢測其純度都達(dá)到95%。根據(jù)單體化合物的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,確定這6種物質(zhì)分別是人參皂苷Rg1、人參皂苷La、人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、擬人參皂苷P-F11、人參皂苷Rd。與傳統(tǒng)的分離方式對比,該方法分離成本低,效率高。為人參皂苷類物質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)、藥理學(xué)試驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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