朱 靖 博, 宋 青 楠, 耿 慧 琴, 許 芹 永

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.大連博邁科技發(fā)展有限公司, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

S-腺苷蛋氨酸(SAM)有“活性甲硫氨酸”之稱(chēng),于1953年被Cantoni[1]發(fā)現(xiàn)。SAM作為人體內(nèi)最重要的甲基供體,在生命活動(dòng)中,使得許多重要物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、碳水化合物等甲基化。SAM還是轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)、轉(zhuǎn)硫反應(yīng)和多胺合成反應(yīng)的促進(jìn)劑。目前SAM的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶促轉(zhuǎn)化法、發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法產(chǎn)率低,底物價(jià)格昂貴,產(chǎn)物易發(fā)生消旋,已經(jīng)很少使用[2]。酶促轉(zhuǎn)化法是利用SAM合成酶催化L-蛋氨酸和ATP合成SAM[3],由于細(xì)胞中SAM合成酶分離純化困難,因此酶促法也無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。發(fā)酵法成本低,易于實(shí)現(xiàn),是目前工業(yè)化生產(chǎn)的主要手段。國(guó)外對(duì)發(fā)酵法制備SAM進(jìn)行了較多的研究[4],并已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。而國(guó)內(nèi)對(duì)SAM制備技術(shù)的研究起步較晚,發(fā)酵水平遠(yuǎn)低于國(guó)外。

釀酒酵母具有較強(qiáng)的SAM胞內(nèi)積累能力,是目前工業(yè)化生產(chǎn)的主要菌株。本文通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母積累SAM能力進(jìn)行考察,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,提高了SAM的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

釀酒酵母,菌株編號(hào)F2103,大連工業(yè)大學(xué)食品發(fā)酵微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

(1)固體培養(yǎng)基(YEPD):葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,瓊脂20 g/L。

(2)種子液培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,校正至pH=6。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,硫酸銨5 g/L,磷酸二氫鉀6 g/L,磷酸氫二鉀3 g/L,硫酸鎂1.5 g/L,L-蛋氨酸1 g/L,校正至pH=6。

1.3 培養(yǎng)條件

種子液制備:挑取一環(huán)菌種,接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵液制備:將種子液按照10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量為50 mL,在30 ℃,180 r/min 條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測(cè)定方法

取5 mL發(fā)酵液4 500 r/min離心15 min收集菌體,用去離子水水洗2次,離心收集菌體,105 ℃ 烘干至恒重,稱(chēng)重。

1.4.2 SAM胞內(nèi)產(chǎn)量的測(cè)定

發(fā)酵液處理:取5 mL發(fā)酵液4 500 r/min離心15 min,收集菌體,按照每克濕菌體加入0.24 mL 乙酸乙酯,0.24 mL水,振蕩破碎30 min,再按照每克濕菌體加入0.56 mL 0.35 mol/L 硫酸振蕩破碎1.5 h,然后將處理液10 000 r/min離心10 min收集上清液,做適當(dāng)稀釋后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

HPLC檢測(cè)條件:色譜柱為C18,流動(dòng)相為40 mmol/L KH2PO4,2 mmol/L庚烷磺酸鈉+體積分?jǐn)?shù)18%甲醇-水,體積流量為1 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,柱溫為室溫。

1.4.3 SAM胞內(nèi)產(chǎn)量的計(jì)算

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

以SAM胞內(nèi)產(chǎn)量作為響應(yīng)值,通過(guò)3個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化。(1)利用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對(duì)SAM胞內(nèi)產(chǎn)量影響顯著的因素,各因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。(2)利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域。(3)利用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型,并最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件,并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(N=12)

2 結(jié)果與討論

2.1 PB實(shí)驗(yàn)確定顯著影響因素

本實(shí)驗(yàn)采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響SAM胞內(nèi)產(chǎn)量的因素進(jìn)行了篩選,選用N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)8個(gè)因素(發(fā)酵溫度,pH,裝液量,接種量,種齡,L-Met質(zhì)量濃度,搖床轉(zhuǎn)速,發(fā)酵時(shí)間)進(jìn)行研究,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

采用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(表2),獲得多元一次擬合回歸方程:

w(SAM)=192.98+15.44A-1.22B+

9.23D-21.58E+30.91G-

18.47H+8.83J+33.42K

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)顯著影響因素的最陡爬坡路徑,L-Met質(zhì)量濃度為正效應(yīng),接種量和發(fā)酵時(shí)間為負(fù)效應(yīng),根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例及實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)其變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出,菌株F2103發(fā)酵產(chǎn)SAM胞內(nèi)最高產(chǎn)量在第二次實(shí)驗(yàn)附近,故選取中心點(diǎn)為接種量10%,L-Met質(zhì)量濃度4.0 g/L,發(fā)酵時(shí)間54 h。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn),菌株在第二次實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)入最大產(chǎn)SAM區(qū)域,確定以接種量10%、L-Met質(zhì)量濃度4.0 g/L、發(fā)酵時(shí)間54 h為中心點(diǎn),然后對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)中每個(gè)因素取3個(gè)水平共進(jìn)行17次實(shí)驗(yàn),Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)表及其結(jié)果

Design-Expert對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,獲得擬合二次多項(xiàng)式回歸方程:

w(SAM)=285.82-11.13A-6.97B+

12.78C-8.85AB-11.67AC+

17.01BC-39.26A2-26.76B2-

32.50C2。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表

利用Design-Expert軟件對(duì)上述模型進(jìn)行優(yōu)化處理,確定其發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度30 ℃,pH為6.0,裝液量60 mL,接種量10%,種齡24 h,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,L-Met質(zhì)量濃度為4.0 g/L,發(fā)酵時(shí)間56 h。模型理論預(yù)測(cè)該條件下SAM胞內(nèi)產(chǎn)量最大值為288.277 mg/g。

各因素響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖1～3。

圖1 發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)SAM胞內(nèi)產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

Fig.1 Chart on effects of fermentation time and inoculum volume on SAM production

圖2 發(fā)酵時(shí)間和L-Met質(zhì)量濃度對(duì)SAM胞內(nèi)產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

Fig.2 Chart on effects of fermentation time and concentration of L-Met on SAM production

圖3 L-Met質(zhì)量濃度和接種量對(duì)SAM胞內(nèi)產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

Fig.3 Chart on effects of concentration of L-Met and inoculum volume on SAM production

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的可靠性,在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,分別得到SAM的胞內(nèi)產(chǎn)量為286.981,289.470,286.396 mg/g, SAM的胞內(nèi)產(chǎn)量平均值為287.615 7 mg/g,與預(yù)測(cè)值288.277 mg/g 非常接近,這表明實(shí)驗(yàn)值和實(shí)際值間有很好的擬合性,優(yōu)化模型可靠。

3 結(jié) 論

通過(guò)3種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合,篩選出對(duì)SAM胞內(nèi)產(chǎn)量影響顯著的3個(gè)因素為接種量、L-Met質(zhì)量濃度和發(fā)酵時(shí)間。得到最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃,pH 6.0,裝液量60 mL,接種量10%,種齡24 h,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,L-Met 質(zhì)量濃度為4.0 g/L,發(fā)酵時(shí)間56 h。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證,得到SAM胞內(nèi)產(chǎn)量287.615 7 mg/g,比優(yōu)化前提高了1.38倍。

[1] CANTONI G L. S-adenosyl-L-methionine:Anewineter-mediate formedenzymatically from L-methionine and adenosinetriphosphate[J]. Biological Chemistry, 1953, 204(1):403-416.

[2] MATOS J R, WONG C H. S-adenosylmethionine:stability and stabilization[J]. Bioorganic Chemistry, 1987, 15(1):71-80.

[3] CANTONI G L. The nature of the active methyl-sonor formed enzymatically from L-methinine and asenosine triphosphate[J]. Journal of American Chemical Society, 1952, 74:2942-2943.

[4] MATOS J R, RAUSHEL F M, WONG C H. S-adenosylmethionine studies on chemical and enzymatic synthesis[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1987, 9(1):39-52.