田照輝，徐紹剛，王巍，胡紅霞，董穎，宋超

(國家淡水漁業(yè)研究中心暨北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100068)

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)又稱應激蛋白，其中HSP70家族高度保守，當機體遭受應激后會被誘導而迅速表達。HSP70具有分子伴侶功能，可以提高機體對應激因子的抵抗能力，在免疫過程中具有重要作用[1-6]。熱休克蛋白因具有廣泛的生物學功能而成為研究熱點。一些學者對黃顙魚、團頭魴、劍尾魚等多種魚類的HSP70基因進行了克隆和研究[5-9]，還有學者建議將HSP70的表達作為潛在性的環(huán)境應激和毒性量化指標[10]。

西伯利亞鱘Acipenserbaerii屬鱘形目、鱘科、鱘屬,為亞冷水性魚類。該魚的養(yǎng)殖利潤較高，因而成魚養(yǎng)殖得到迅速推廣。在成魚養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖戶的盲目選址以及為追求產(chǎn)量加大鱘的放養(yǎng)密度，由此而引起的擁擠脅迫和夏季水溫過高引起的高溫脅迫時有發(fā)生，致使西伯利亞鱘抗病力下降，病害增加。本研究中，作者首次克隆了西伯利亞鱘HSP70 cDNA的全長，并對其在各組織中的分布進行了分析，旨在為研究HSP70在西伯利亞鱘抗應激過程中的作用和機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用西伯利亞鱘取自北京市水產(chǎn)科學研究所國家級鱘魚良種場， 其中1尾(150 g)用于基因克隆試驗，3尾(165 g±23.46 g)用于組織分布試驗。

RNeasy mini kit提取試劑盒和RNase-Free DNase Set為Qiagen公司產(chǎn)品；Trizol Reagent、DNaseI、RT-PCR試劑盒購于Invitrogen公司；ExTaq、SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)和pGM-19T Vector載體連接試劑盒購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；實時定量試劑為AB公司生產(chǎn)的2×Sybrgreen PCR Master Mix?？寺【闐H10B由北京市水產(chǎn)科學研究所生物技術(shù)與育種研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物合成及測序 所有引物用Primer 5.0設計(表1)，其中中間片段引物HSPFP1、HSPRP2根據(jù)GenBank中登錄的白鱘、鯉、斑馬魚、鮭的HSP70基因保守區(qū)設計，其中3′HSP1、3′HSP2為3′RACE特異引物，5′GSP1為5′RACE特異引物，2010722F和2010722R為克隆OFR引物，4f和4r為實時定量引物。所有引物合成及序列測定均由北京擎科生物工程有限公司完成。

表1 試驗用引物

1.2.2 HSP70 cDNA全長序列的獲取

1)總RNA的提取。取1尾西伯利亞鱘(150 g)于水溫為24 ℃的水池中暫養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)入水溫為30 ℃的水池中急性熱應激1.5 h。取其肝臟，用Trizol法提取總RNA，用BIORAD紫外分光光度計測定RNA的濃度和OD值，根據(jù)OD260nm/OD280nm值和瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的質(zhì)量。

2)合成cDNA第一鏈。用Dnase I處理總RNA，按照SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)使用說明，以Oligo(dT)20為引物進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。

3)中間片段的分離。以cDNA第一鏈為模板，根據(jù)GenBank中登錄的HSP70保守區(qū)設計引物HSPFP1和HSPRP2擴增西伯利亞鱘HSP70中間片段。PCR反應體系包括10×buffer 2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、10 μmol/L引物各0.8 μL、5 U/μL ExTaq 0.2 μL、模板2.0 μL，加滅菌ddH2O補至20 μL。反應程序為：94 ℃下預變性3 min；94 ℃下變性45 s，55 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸2 min,共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用Axygen膠回收試劑盒回收，連接pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化至DH10B大腸桿菌感受態(tài)細胞中，進行藍白斑菌篩選。挑取單個白色菌落過夜培養(yǎng)，通過菌液鑒定挑選陽性菌液進行測序。

4)3′端和5′端擴增。3′HSP1、3′HSP2為根據(jù)中間片段序列設計的3′端特異性引物，其中3′HSP2為嵌套引物，AP和AUAP為非特異性引物。第一輪PCR反應以cDNA第一鏈為模板，利用3′HSP1和錨定引物AP進行擴增；第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板，以3′HSP2和AUAP為引物，進行巣式PCR得到特異性單一片段。使用Clontech Race試劑盒對5′RACE進行擴增。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收，連接轉(zhuǎn)化，進行藍白斑菌篩選和菌液鑒定，對陽性菌液進行測序。

5)HSP70 cDNA全長序列的確定。使用DNAStar中的SeqManⅡ?qū)⑸鲜鲋虚g片段、3′端和5′端片段拼接成完整的西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列。為驗證全長拼接的準確性，在OFR兩端設計引物2010722F和2010722R，克隆接近OFR的長片段，并與全長進行比對。

6)序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以及蛋白結(jié)構(gòu)的預測。使用軟件DNAstar、ClustalX 1.83、Mega 4、Antheprot 2000以及在線軟件SignalP完成。

1.2.3 HSP70 mRNA的組織分布

1)取樣。取體質(zhì)量為(165±23.46)g(n=3)的西伯利亞鱘于17.5 ℃水中暫養(yǎng)一周，試驗時轉(zhuǎn)入含1 g/L丁香酚的水中，迅速麻醉后取其肝臟、鰓、脾臟、心臟、肌肉、中腸、性腺、腦8種組織，于液氮中速凍，-80 ℃下保存。

2)RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄。使用Qiagen公司生產(chǎn)的 RNeasy mini kit試劑盒提取總RNA，在RNase-Free DNase set柱上處理基因組，用紫外分光光度計測定OD值，保證總RNA樣本的OD260 nm/OD280nm值為1.9～2.0，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的完整性。

3)熒光實時定量。采用SYBR Green法，將待測樣品cDNA經(jīng)過系列稀釋后作為標準品，構(gòu)建相對標準曲線[10-12]。具體步驟如下：取總RNA 1 μg，用SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)進行反轉(zhuǎn)錄，并進行無反轉(zhuǎn)錄酶(NRT)和無RNA(NOT)對照。實時定量引物4f、4r的擴增片段為100 bp，預先采用普通PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證引物的特異性。實時定量時取1尾魚8種組織的cDNA等量混合，梯度稀釋30～36倍為模板，假定稀釋36倍的模板的copy值為1，作相對標準曲線。將各組織的cDNA稀釋16.3倍作為模板，與標準曲線同時定量分析，并與NTC(無模板陰性對照)、NRT、NOT進行對照。反應總體積為20 μL，包括2×Sybrgreen PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L 4f、4r各0.7 μL，模板2 μL，用滅菌ddH2O補至20 μL。反應程序為：95 ℃下預變性10 min；95 ℃下變性15 s，58 ℃下退火15 s，72 ℃下延伸45 s，共進行40個循環(huán)，并采集熒光信號。每個模板重復3次，實時定量結(jié)束后立即進行熔解曲線分析，熔解曲線從55 ℃到95 ℃，每30 s升高0.5 ℃，采集熒光15 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進行處理，用One-Way進行單因素方差分析，如果差異顯著則用Ducan’s法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA

分離制備的總RNA的OD260 nm/OD280nm值為1.9～2.0，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S、18S rRNA條帶清晰(圖1)，說明提取的RNA質(zhì)量很好，較完整，適合進行反轉(zhuǎn)錄。

2.2 HSP70 cDNA全長

用引物HSPFP1、HSPRP2擴增的中間片段經(jīng)克隆后測序得到1 182 bp片段，3′RACE經(jīng)克隆后測序為923 bp，5′RACE經(jīng)克隆后測序為630 bp(圖1)。將上述中間片段、3′和5′序列使用DNAStar軟件中的SeqManⅡ拼接得到西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列全長為2 343 bp，該序列已登錄GenBank(登錄號為HM348777)。用引物2010722F和2010722R擴增OFR得到的片段為1 958 bp，與設計片段比對，除幾處突變外完全一致。

2.3 序列分析

西伯利亞鱘HSP70 cDNA的全序列為2 343 bp，通過DNAstar軟件中的Editseq分析，5′非編碼區(qū)為140 bp，3′非編碼區(qū)為256 bp，具有AATAA的加尾信號及多聚A尾?？勺x編碼框(ORF)為1 947 bp，編碼為648個氨基酸。氨基酸殘基中，負電荷殘基(D,E)為96個，正電荷殘基(K,R)為81個，親水性殘基(A,I,L,F,W,V) 為209個，極性殘基(N,C,Q,S,T,Y)為 161個，整個蛋白帶負電荷-13.960(pH 7.0)，相對分子質(zhì)量為71 000，等電點為5.21，具有細胞質(zhì)特征性保守序列EEVD(645～648aa)，C端重復序列為GGMP(617～624 aa)。使用Antheprot 2000搜索到該序列中含有HSP70的3個特征序列(圖2)，分別為IDLGTTYS([IV]-D-L-G-T-[ST]-x-[SC], 11～18 aa)、IFDLGGGTFDVSIL([LIVMF]-[LIVMFY]-[DN]-[LIVMFS]-G-[GSH]-[GS]-[AST]-x(3)-[ST]-[LIVM]-[LIVMFC], 199～212 aa)和IVLVGGSTRIPKIQK([LIVMY]-x-[LIVMF]-x-G-G-x-[ST]-{LS}-[LIVM]-P-x-[LIVM]-x-[DEQKRSTA]， 336～350aa)。KRKYKKDISDNKRAVRRL和RARFEEL為推測的熱休克蛋白核定位序列。

注：1為引物HSPFP1、 HSPRP2擴增的中間片段；2為3′端；3為5′端；4為總RNA。Note:1，the fragments of the primers HSPFP1 and HSPRP2;2，the fragment of 3′ Race; 3，the fragment of 5′ Race; 4，the total RNA.圖1 西伯利亞鱘總RNA和HSP70 cDNA的擴增產(chǎn)物Fig.1 The amplification products of total RNA and HSP70 cDNA in Siberian sturgeon Acipenser baerri

2.4 同源性分析

在GenBank中選取部分魚類、兩棲類和爬行類動物的氨基酸序列使用軟件ClustalX 1.83進行比對，用Mega 4構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap驗證重復1 000次(圖3)。從圖3可見，

圖2 西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列及推導出的氨基酸序列Fig.2 The cDNA nucleotide sequence of HSP70 and the amino acids deduced in Siberian sturgeon Acipenser baerii

續(xù)圖2 西伯利亞鱘HSP70 cDNA序列及推導出的氨基酸序列Cont.Fig.2 The cDNA nucleotide sequence of HSP70 and the amino acids deduced in Siberian sturgeon Acipenser baerii

圖3 西伯利亞鱘HSP70氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)Fig.3 Phylogenetic tree of HSP70 amino acid sequence in Siberian sturgeon(NJ method)

非洲爪蛙蟾、密西西比短吻鱷、美西螈與西伯利亞鱘的HSP70聚為一支，西伯利亞鱘和美西螈親緣關(guān)系較近。

2.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和功能預測

用DNAStar軟件中的Protean對西伯利亞鱘熱休克蛋白的二級結(jié)構(gòu)、抗原位點和親水性等進行預測 (圖4)。經(jīng)Hydropathy-Kyte-Doolittle預測發(fā)現(xiàn)，親水性區(qū)域遠遠大于疏水性區(qū)域，說明該蛋白是親水性的。經(jīng)Antigenic-Jameson-Wolf預測潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇，發(fā)現(xiàn)該蛋白的抗原位點豐富，具有良好的抗原性。用Chou-Fasman方案預測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋區(qū)占40.7%，β-折疊區(qū)占23.4%，轉(zhuǎn)角區(qū)占30.2%;用Gamier-Roboson方案預測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋區(qū)占47.5%，β-折疊區(qū)占35.9%，轉(zhuǎn)角區(qū)占6.47%，無規(guī)則卷曲區(qū)占10.2%。兩種方案的預測結(jié)果均說明該蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。利用信號肽預測工具SignalP對西伯利亞鱘HSP70蛋白序列在線搜索，使用神經(jīng)網(wǎng)絡法(NN)和隱馬科夫模型(HMM)進行預測，NN預測結(jié)果表明，該蛋白沒有信號肽位點；HMM預測結(jié)果表明，該信號肽概率極低，無信號肽。

圖4 用DNAStar軟件預測西伯利亞鱘HSP70的二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted HSP70 secondary structure in Siberian sturgeon by DNAStar

2.6 西伯利亞鱘HSP70 mRNA的組織分布

實時定量時取1尾魚8種組織的cDNA等量混合，梯度稀釋30～36倍為模板，假定稀釋36倍的模板的copy值為1，作相對標準曲線(圖5)，儀器根據(jù)標準曲線和各組織Ct值自動給出copy值。所得標準曲線斜率為-3.3611，R2=0.9956，擴增效率為98.4%，說明該標準曲線可靠。熔解曲線分析沒有雜峰，說明產(chǎn)物單一。NTC(無模板陰性對照)、無反轉(zhuǎn)錄酶(NRT)和無RNA(NOT)對照均無信號，表明試驗過程沒有外源污染和基因組污染。本試驗結(jié)果表明，水溫為17.5 ℃時，西伯利亞鱘肝臟、鰓、脾臟、心臟、肌肉、中腸、性腺、腦8種組織中均有HSP70表達(圖6)，其中脾臟中的表達量最高，鰓中的次之，肝臟中的最低。除心臟與性腺的表達量、中腸與腦的表達量之間差異不顯著外(P>0.05)，其余各組織中的表達量之間差異均顯著(P<0.05)。

圖5 實時定量標準曲線Fig.5 The Standard curve by Real-time PCR

注：標有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。Note:The means with the different letters are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters are not significant differences.圖6 西伯利亞鱘HSP70 mRNA的組織分布Fig.6 Relative expression of HSP70 mRNA in 8 tissues in Siberian sturgeon Acipenser baerii

3 討論

本研究中得到了西伯利亞鱘HSP70 cDNA的全序列，但由于熱休克蛋白家族成員眾多，保守性強，成員間有一定的堿基同源性，存在不同基因被錯誤拼接的可能，所以又進行了OFR克隆與設計片段的比對，發(fā)現(xiàn)除幾處突變外完全一致，說明拼接的為同一序列。經(jīng)NCBI Blast測序，所得cDNA序列與其它生物的HSP70 cDNA序列具有較高的同源性，與牙鲆Paralichthysolivaceus的相似度為82%，與草魚Ctenopharyngodonidella的相似度為84%。GenBank中高首鱘Acipensertransmontanus(AY880255)、大西洋鱘Acipensersturio(EU816599)只有HSP70 cDNA片段，通過DNAssist比對與所得序列中間片段基本一致。所得序列全長為2 343 bp，可讀編碼框(ORF)為1 947 bp，編碼為648個氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果表明，該序列中含有HSP70家族的3個特征序列——IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQK，所以得到的序列是HSP70 cDNA序列，序列C末端具有熱休克蛋白高度保守的細胞質(zhì)特異調(diào)控序列EEVD[7,9]，說明該蛋白是細胞質(zhì)熱休克蛋白。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，該蛋白是親水性的，以α-螺旋為主，具有豐富的抗原位點，無信號肽位點。

熱休克蛋白家族中HSP70家族成員最多，包括兩種蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)型HSC70(Heat shock cognate protein 70)和誘導型HSP70(Heat shock protein 70)，這兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列90%相同，大部分特性也相同[13]。魚類與哺乳動物、兩棲類非洲爪蛙蟾HSP70氨基酸序列相似度平均值分別為86.2%和86.8 %[14]，進化較為保守。本研究中，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，牙鲆、斑馬魚和人熱休克蛋白各自的結(jié)構(gòu)型和誘導型聚成一支，西伯利亞鱘與非洲爪蛙蟾Xenopuslaevis、密西西比短吻鱷Alligatormississippiensis和美西螈Ambystomamexicanum聚為一支，與美西螈親緣關(guān)系最近，這與上述觀點相符。高宇等[14]認為，雜交鱘Husohuso♀×Acipenserschrenck♂、匙吻鱘與團頭魴、鯽、鯉、斑馬魚聚為一個類群，和鯽的親緣關(guān)系最近，可能因為他們使用的是部分核苷酸序列構(gòu)建的MP系統(tǒng)發(fā)育樹。

魚類結(jié)構(gòu)型HSC70基因具有內(nèi)含子，而誘導型HSP70基因沒有內(nèi)含子[2, 15];誘導型HSP70在正常細胞中不表達或表達量很少，在應激條件下表達量迅速增高，而結(jié)構(gòu)型熱休克蛋白在所有細胞中均有表達[16]。本研究中，克隆的HSP70在8種組織中都有一定的基礎表達，符合結(jié)構(gòu)型的表達特征。試驗中用丁香酚迅速將魚麻醉后取樣，避免了因操作而引起的應激。丁香酚對西伯利亞鱘稚魚耗氧率和幼魚生化指標能產(chǎn)生一定的影響[17]，但能否誘導西伯利亞鱘熱休克蛋白的表達尚未見報道。

Deane等[18]對熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)進行了分析，認為銀鯛Sparussarba結(jié)構(gòu)型HSP70有多個GGXP模體和九肽模體SGPTIEEVD，誘導型HSP70多數(shù)情況只出現(xiàn)一次GGXP，九肽結(jié)構(gòu)也不同于結(jié)構(gòu)型的SGPTIEEVD。這與明建華等[7]對團頭魴Megalobramaamblycephala和Cui等[19]對三疣梭子蟹Portunustrituberculatus的熱休克蛋白基因克隆結(jié)果相同。本研究中，克隆的HSP70氨基酸序列中GGMP重復兩次，并含有九肽模體SGPTIEEVD，按照Deane等[18]的觀點應為結(jié)構(gòu)型HSC70。但是人的誘導型熱休克蛋白HSP701A/1B中具有SGPTIEEVD九肽結(jié)構(gòu)模體(NP_005336.3)，而結(jié)構(gòu)型HSP701-Like(NP_005518.3)中卻無此九肽結(jié)構(gòu)[20]；非洲爪蛙蟾Xenopuslaevis誘導型HSP70 1B(NP_001091238.1)中也含有九肽模體SGPTIEEVD和重復的GGMP[21]。這與Deane等[18]的結(jié)論不一致。

目前對鱘熱休克蛋白的研究較少，僅有部分學者使用免疫印跡法對其它魚類的熱休克蛋白進行了研究[22-24]。中吻鱘Acipensermedirostris仔魚受到熱應激后，會導致畸形個體和正常個體中HSP72 和HSP78的表達量持續(xù)升高，HSP60表達水平可能與仔魚熱應激易損性相關(guān)[23]。投飼率和溫度均能引起高首鱘Acipensertransmontanus熱休克蛋白的變化，且HSP70的上升幅度較HSP60更為明顯，因而HSP70是更靈敏的生物學指標[24]。鱘屬于亞冷性魚類，水溫是非常重要的脅迫因子[22,24]。研究表明，魚類經(jīng)過長期的高溫馴化可以改變其機體內(nèi)HSP70的表達機制[25]。所以研究西伯利亞鱘在不同生態(tài)環(huán)境中HSP70 cDNA的表達，有助于在分子水平上研究西伯利亞鱘的抗逆機理。本研究中克隆了西伯利亞鱘HSP70的cDNA序列，通過實時定量，得到了其在各組織中的分布情況，其中脾臟中的表達量最高，鰓中的表達量次之，肝臟中的表達量最低(P<0.05)，因此，HSP70表達量較高的組織可用于監(jiān)測西伯利亞鱘的應激反應狀態(tài)。

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