王吉橋，王志香，張凱，張玉滿，姜玉聲,劉春寶，吳巖強

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023;2.遼寧每日農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司，遼寧 盤錦 124212；3. 大連棒槌島海產(chǎn)有限公司,遼寧 大連 116000)

硒是動物體內(nèi)必需的微量元素,是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 的輔助因子。缺硒會影響畜禽的繁殖，但過量的硒對畜禽也有毒性[1]。許多研究表明，鮭科魚類缺硒時會導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良、貧血甚至死亡[2]。在飼料中添加0.17～2.02 g/kg亞硒酸鈉等無機硒和富硒酵母等有機硒，能顯著提高草魚Ctenopharyngodonidella[3]、石斑魚Epinephelusmalabaricus[4]、鯽Carassiusauratusgibelio[5]、斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus[6]、尼羅羅非魚Oreochromisniloticus[7]、中國對蝦Fenneropenaeuschinensis[8]、凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei[9]、中華鱉Trionyxsinensis幼鱉[10]和皺紋盤鮑HaliotisdiscushannaiIno[11]等經(jīng)濟水生動物的生長速度、成活率和消化酶活性，增強其免疫力。但是，目前有關(guān)在飼料中添加硒對仿刺參Apostichopusjaponicus生長和免疫力的影響尚未見報道，至于仿刺參飼料中添加硒的適宜類型和劑量等尚屬空白。

仿刺參的營養(yǎng)和藥用價值很高，是中國北方海水養(yǎng)殖的新增長點。隨著中國經(jīng)濟的發(fā)展和人們保健意識的增強，仿刺參的消費量急劇增加，而養(yǎng)殖面積的銳減更刺激了仿刺參養(yǎng)殖的快速和無序增長，導(dǎo)致病害不斷滋生蔓延。濫用抗菌素等化學(xué)藥物威脅著環(huán)境和食品安全。因此，高效、經(jīng)濟、安全且具有免疫增強功能的飼料是仿刺參養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)；在飼料中添加適宜類型和劑量的硒是研發(fā)增強仿刺參免疫功能飼料的主要途徑之一。目前，畜禽和魚蝦飼料中補充的硒制劑主要有兩種, 即亞硒酸鈉等無機硒和富硒酵母等有機硒，其中Bell等[12]、Lorentzen等[13]、Wang等[6]、魏文志等[14]、鄭宗林等[15]的試驗證明，動物對有機硒的利用效果好于無機硒，特別是對蛋氨酸硒的利用效果更好。筆者曾研究了飼料中添加不同類型的硒對仿刺參幼參生長和免疫指標(biāo)的影響，證明蛋氨酸硒的促生長和增強免疫力的效果最好[16]，但沒有詳細(xì)研究與其劑量的相關(guān)性。本試驗中，作者在飼料中添加不同梯度的蛋氨酸硒，研究了硒的劑量對仿刺參生長及免疫能力的影響，旨在豐富仿刺參的營養(yǎng)學(xué)內(nèi)容，為科學(xué)配制仿刺參飼料，提高仿刺參養(yǎng)殖的經(jīng)濟和生態(tài)效益提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用仿刺參初始體質(zhì)量為1.30～1.68 g，取自遼寧每日農(nóng)業(yè)集團(tuán)有限公司水產(chǎn)苗種繁育基地。蛋氨酸硒購自浙江韋豐飼料添加劑有限公司，硒含量標(biāo)準(zhǔn)為1 500 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的配制 基礎(chǔ)飼料配方(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：大豆蛋白7.0，魚粉11.0，紅薯粉和土豆粉等30.0，海泥40.0，蝦糠5.0，貝殼粉3.9，酵母1.0，礦物鹽 0.8，賴氨酸 0.36，蛋氨酸 0.37，蘇氨酸 0.37，黃原膠 0.2。基礎(chǔ)飼料中粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.60%、1.69%和55.63%。

其中紅薯粉和土豆粉等混合淀粉，在高壓鍋(120 ℃)內(nèi)糊化15 min，然后烘干、研磨、粉碎。飼料中所有原料均經(jīng)100目篩絹過濾，除去上層，混合均勻，制成粉狀混合物。投喂前用80 ℃左右的熱水?dāng)嚢杈鶆?，室溫下待酵母發(fā)揮作用后即成為松軟合適的膏狀飼料。由于飼料中添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的黃原膠增稠劑，因此飼料不易分散。

在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg的蛋氨酸硒，以不添加蛋氨酸硒的飼料作為對照組。海水中的硒含量為0.03～6.00 μg/L，飼料原料中的硒含量為0.43 mg/kg。

1.2.2 試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理 將仿刺參在實驗室水槽中馴養(yǎng)20 d后，選擇體質(zhì)量相近的健康個體分成6組，放入容積為40 L的塑料水箱中，每箱放15頭仿刺參幼參，投喂硒添加量為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg的6種飼料，分別記為對照組、A、B、C、D、E組，每組設(shè)3個重復(fù)。

試驗水箱內(nèi)24 h充氣。水溫為14.0～8.0 ℃，鹽度為30.0～32.0，pH為7.5左右。試驗期間采用自然光照，隔天換水100%。在換水的當(dāng)天17:00投喂，開始時投喂量為仿刺參體質(zhì)量的2.0%，隨著仿刺參的生長和攝食量的增加投喂量增大，稍過量投喂。投喂時將糊狀飼料均勻涂在波紋板上，放在水槽底部，將充氣石壓在板下，涂抹飼料面朝上。仿刺參攝食后排出的糞便呈規(guī)則的長條狀，不分散，有利于殘餌和糞便的辨別和收集。

試驗共進(jìn)行60 d，分3個周期，每個周期20 d。

1.2.3 項目的測定與方法 試驗結(jié)束時，每組隨機取20頭仿刺參，抽取體腔液，在-20 ℃下保存，用于體腔液中酶活力的測定。取各組仿刺參的腸，去除腸內(nèi)糞便，采用冷凍干燥法對腸和體壁進(jìn)行干燥后用于測定硒的含量，余下的仿刺參體壁風(fēng)干后用于粗蛋白、粗灰分和粗脂肪等成分的測定。

市政府于2010年年底出臺《關(guān)于加快推進(jìn)郊區(qū)集約化供水的實施意見》，將郊區(qū)集約化供水列入市政府實事項目和重大工程重點推進(jìn)。截至2013年11月底，上海市陸域部分的集約化供水工作已完成，共關(guān)閉郊區(qū)中小型水廠150座,取消內(nèi)河取水口94個，注銷深井取水許可證161個，達(dá)到了集中保護(hù)水源、優(yōu)化水廠布局、壓縮地下水開采量、提高供水水質(zhì)和管理服務(wù)水平、改善郊區(qū)發(fā)展環(huán)境等預(yù)期效應(yīng)，受到廣大郊區(qū)市民的歡迎。

采用氫化物發(fā)生-原子吸收光譜法，用通用的TAS-990AFG型原子吸收分光光度計測定仿刺參體壁中硒的含量。樣品經(jīng)冷凍干燥后，用10～15 mL濃硝酸-高氯酸消解，在波長為196 nm，載氣流量為150～180 mL/min條件下測定。

使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，并按其方法測定仿刺參體腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和酸性磷酸酶(ACP)的活性。

每飼養(yǎng)20 d測定各水槽中仿刺參的總質(zhì)量，計算其特定生長率(SGR):

SGR=[(lnWf-lnW0)/t]×100%,

其中:Wf為終末體質(zhì)量(g);W0為初始體質(zhì)量(g);t為飼養(yǎng)時間(d)。

在每個飼養(yǎng)周期結(jié)束前5 d，投喂添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的三氧化二鉻(Cr2O3)飼料，收集無破損的糞便，烘干，用來測定仿刺參對飼料的消化率。

總表觀消化率= (1- 飼料中Cr2O3含量/糞便中Cr2O3含量) ×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 飼料中蛋氨酸硒的添加量對仿刺參特定生長率及體成分的影響

經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)，各組仿刺參的成活率均為100%，說明飼料中添加蛋氨酸硒對成活率沒有顯著影響，但對仿刺參的生長有顯著影響。從表1可見：當(dāng)硒添加量為0.2～0.6 mg/kg時，仿刺參的特定生長率隨添加量的增加而增大，C組顯著高于對照組、A組(P<0.05)；之后，隨著蛋氨酸硒添加量的增加，特定生長率反而下降，特別是當(dāng)添加量為1.0 mg/kg(E組)時，仿刺參的特定生長率最低，除與A組差異不顯著外(P>0.05)，顯著低于其余各組(P<0.05)。這說明飼料中硒的添加量有一個界限，呈現(xiàn)“低—高—低”的拋物線形狀，當(dāng)添加量為0.6 mg/kg時，仿刺參的生長效果最好；超過這個劑量時，反而對生長有副作用。

表1 飼料中蛋氨酸硒添加量對仿刺參特定生長率的影響

注：同列中標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)，下同。

Note: Means in the same column followed by different letters denote significant differences at 0.05, and the means in the same column followed by the same letters represent insignificant differences at 0.05，et sequentia.

從表2可見：各試驗組仿刺參體壁干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量均顯著高于對照組(P<0.05)，其中B組最高；各組仿刺參體壁干物質(zhì)中粗脂肪的含量差異均不顯著(P>0.05)；B組仿刺參體壁干物質(zhì)的粗灰分含量最低，顯著低于對照組(P< 0.05)，而其它各組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 飼料中蛋氨酸硒的添加量對仿刺參表觀消化率的影響

從表3可見：各試驗組仿刺參對飼料干物質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率的變化規(guī)律基本相同，均在添加量為0.6 mg/kg時最高，與對照組差異顯著(P< 0.05)。這表明在飼料中添加0.6 mg/kg蛋氨酸硒能促進(jìn)仿刺參對飼料干物質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率，超過這個添加量，仿刺參對干物質(zhì)和粗蛋白的消化率反而顯著低于對照組(P< 0.05)，這與蛋氨酸硒的添加量對仿刺參特定生長率的影響一致。仿刺參攝食添加不同劑量蛋氨酸硒飼料時，對飼料粗脂肪的表觀消化率沒有顯著差異(P>0.05)。

表2飼料中蛋氨酸硒的添加量對仿刺參體壁干物質(zhì)中各成分的影響

Tab.2 Approximate composition (in dry matter) of the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of selenomethioninew/%

表3 仿刺參攝食添加不同量的蛋氨酸硒飼料時的表觀消化率

2.3 飼料中蛋氨酸硒的添加量對仿刺參腸道和體壁中硒含量的影響

各試驗組仿刺參體壁和腸道中的硒含量呈現(xiàn)“低—高—低”的變化趨勢(圖1)，即隨飼料中蛋氨酸硒添加量的增加，仿刺參體壁和腸道中的硒含量逐漸增加。其中B組仿刺參體壁中的硒含量最高，C組仿刺參次之，均顯著高于其它組(P<0.05)；而E組的含量最低，顯著低于其余各組(P<0.05)；A組和D組仿刺參體壁中的硒含量與對照組差異均不顯著(P> 0.05)。

仿刺參腸道中硒含量的變化趨勢基本與體壁中的硒含量相似(圖1)，但有所不同的是，C組仿刺參腸道中硒的含量最高，顯著高于A、B、E組和對照組(P<0.05)；當(dāng)飼料中硒的添加量高于0.6 mg/kg時，仿刺參腸道中硒的含量反而降低，即腸道中硒含量的變化比體壁中硒的變化更敏感。

圖1 攝食添加不同劑量蛋氨酸硒飼料的仿刺參體壁和腸道干物質(zhì)中的硒含量Fig.1 The selenium levels in dry matter in the body wall,and intestine of the sea cucumber juveniles fed the diets containing different levels of selenomethionine

2.4 飼料中蛋氨酸硒的添加量對仿刺參體腔液中酶活力的影響

從表4可見：仿刺參體腔液中超氧化物歧化酶(SOD)的活力隨飼料中蛋氨酸硒添加量的增加而升高，當(dāng)添加量達(dá)0.8 mg/kg時，SOD活力最高，除E組外,其余各試驗組均顯著高于對照組(P<0.05)；當(dāng)添加量為1.0 mg/kg時，SOD活力最低，顯著低于其余各組(P<0.05)。當(dāng)?shù)鞍彼嵛砑恿俊?.8 mg/kg時，仿刺參體腔液中過氧化氫酶(CAT)的活力均顯著高于對照組(P< 0.05)；而蛋氨酸硒添加量為1.0 mg/kg時，CAT活力最低，顯著低于其余各組(P< 0.05)。各試驗組仿刺參體腔液中酸性磷酸酶(ACP)的活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

表4 攝食添加不同劑量蛋氨酸硒飼料的仿刺參幼參體腔液中幾種酶的活力

3 討論

3.1 仿刺參對飼料中硒的需要量

動物體內(nèi)的硒主要來自攝取的食物，對有機硒的利用率大于無機硒。Bell等[12]給大西洋鮭Salmosalar投喂魚粉、亞硒酸鈉、半胱氨酸硒和蛋氨酸硒等不同形式的硒，結(jié)果發(fā)現(xiàn):飼料中加硒組的魚的增重率大于缺硒組的魚,鮭對蛋氨酸硒的消化率最高 (92%)，對魚粉的消化率最低(47%)。異育銀鯽飼料中添加有機硒(多糖硒和蛋白硒0.2 mg/kg飼料),魚的增重率比對照組和無機硒組分別高15.29%和14.59%，而飼料系數(shù)降低12.49%和 12.35%[14]。本試驗中，在仿刺參飼料中添加蛋氨酸硒，取得了較好的效果。經(jīng)測定，本試驗的基礎(chǔ)飼料中硒的含量為0.2355 mg/kg，這比常用魚類飼料中的含量高。

動物對硒的營養(yǎng)需要存在適宜劑量范圍,即硒的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線[17-19]。超過這個范圍,會引起硒缺乏癥或急、慢性中毒。本試驗結(jié)果表明：隨著飼料中硒添加量的增加，仿刺參的特定生長率和體壁中蛋白質(zhì)的含量都提高，當(dāng)硒添加量為0.6 mg/kg時，達(dá)到最高值，然后再提高添加量，特定生長率和體壁中蛋白質(zhì)的含量均下降。這表明本試驗基礎(chǔ)飼料中蛋氨酸硒的最適添加量為0.6 mg/kg，當(dāng)添加量達(dá)到1.0 mg/kg時，仿刺參的生長效果低于對照組，說明硒的含量過高會抑制仿刺參的生長。Lin等[4]的研究表明，飼料中硒的添加量為0.77 mg/kg時，石斑魚Epinephelusmalabaricus幼魚的增重率和飼料效率最高；硒添加量為4.00 mg/kg時,其增重率和飼料效率最低。這與本試驗結(jié)果接近，符合Weinberg 原理。蘇傳福等[3]發(fā)現(xiàn)，草魚攝食硒添加量為0.6 mg/kg的飼料時，其生長、營養(yǎng)組成和消化酶活性與本試驗結(jié)果一致。本試驗中，仿刺參幼參攝食硒添加量為0.6 mg/kg的飼料時與未添加硒組(對照組)生長效果顯著不同，說明基礎(chǔ)飼料中原有的硒含量不能滿足仿刺參的生長需求，必須在飼料中添加硒。

本試驗中，當(dāng)飼料中添加0.6 mg/kg蛋氨酸硒時，仿刺參體壁中干物質(zhì)的含量最高，顯著高于對照組。這可能是飼料中的蛋氨酸硒替代蛋氨酸進(jìn)入仿刺參體內(nèi)，促進(jìn)了仿刺參的生長。通常，硒以兩種形式存在于蛋白質(zhì)中：一種是可離解的因子，另一種是以共價鍵與氨基酸結(jié)合的形式存在。第一種形式的硒多見于細(xì)菌，而哺乳動物中的硒以共價鍵的形式存在于蛋白質(zhì)中[18]，其中主要涉及到兩個氨基酸，即硒半胱氨酸(Se—Cys)和硒蛋氨酸(Se—Met)，后者在蛋白質(zhì)中可代替蛋氨酸的存在，而Se—Cys只在蛋白質(zhì)的特定位點發(fā)揮特殊的功能，主要催化氧化—還原反應(yīng)[13]。

3.2 硒添加量對仿刺參體壁和腸道中硒含量的影響

本試驗中，仿刺參的體壁和腸道干物質(zhì)中硒的含量都隨飼料中硒含量的增加而增加，當(dāng)硒含量分別為0.4 mg/kg和0.6 mg/kg時達(dá)到最高點，然后再隨著飼料硒含量的增加而下降。沈梅等[20]研究表明，飼料中硒含量的差異對動物體內(nèi)硒含量影響較大，飼料中添加硒可以直接提高動物體中硒的含量。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)，飼料中蛋氨酸硒含量與斑點叉尾鮰肌肉中硒含量的相關(guān)性最好，酵母硒次之。以上學(xué)者的試驗結(jié)果都與本試驗的結(jié)果相吻合。另外，仿刺參腸道中硒的含量高于體壁中硒的含量，說明體壁中的硒是仿刺參的消化道吸收了飼料中的硒，并經(jīng)過新陳代謝最終到達(dá)體壁中。生成的途徑不同，從而導(dǎo)致二者硒的含量有一些差異。

3.3 硒對仿刺參體液免疫的影響

CAT和SOD都是生物體清除活性氧、免受細(xì)胞氧化傷害的主要抗氧化酶類，在防御機體衰老和生物分子損傷等方面有著極為重要的作用。硒作為一種抗氧化劑并不是直接發(fā)揮作用,而是作為依賴硒的谷胱甘肽過氧化物酶的核心組成部分,參與有機和無機過氧化物的清除過程[21-23]。當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時, 通常SOD活性升高，表現(xiàn)為一種抗應(yīng)激反應(yīng)， 而當(dāng)受到重度逆境脅迫時，SOD 活性通常降低，使機體積累過量的活性氧，導(dǎo)致生物體的傷害[24]。飼料中添加硒對皺紋盤鮑血清中CAT、SOD都有顯著影響[11]，當(dāng)硒添加量為0.6 mg/kg時，能使皺紋盤鮑血清中的抗氧化物酶系統(tǒng)總體達(dá)到相對平衡,有效地抵抗氧化損害。

本試驗中，仿刺參攝食不同添加量的蛋氨酸硒飼料時，體腔液中的SOD活力顯著不同，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)硒添加量為0.8 mg/kg時最高，其次是在0.6 mg/kg時。王宏偉等[25]發(fā)現(xiàn)，中華米蝦Caridinadenticulatasinensis體內(nèi)SOD 的活性隨著飼料中硒添加量的增加先上升后下降，這與本試驗結(jié)果相似。硒元素作為仿刺參生長不可缺少的營養(yǎng)元素，在飼料中適量添加可以提高仿刺參體內(nèi)SOD的活力，增強其免疫力。

本試驗結(jié)果表明，添加硒的各組仿刺參體腔液中CAT的活力(除1.0 mg/kg組外)均顯著高于對照組，其中添加量為0.4 mg/kg時最高，其次是0.6 mg/kg時。這說明硒含量的增加對提高仿刺參CAT的活力有一定的協(xié)同作用，但高劑量的硒卻會抑制CAT的活力。

ACP能參與水生動物的磷酸酯代謝，具有調(diào)節(jié)新陳代謝、促進(jìn)能量轉(zhuǎn)化和信號傳導(dǎo)等作用。本試驗中，各試驗組仿刺參體腔液中的ACP酶活力明顯不同，但均顯著高于對照組，其中添加量為0.4 mg/kg時ACP酶活力達(dá)到最高，其次是0.6 mg/kg時，表明飼料中添加適當(dāng)劑量的蛋氨酸硒能促進(jìn)仿刺參對生物磷的代謝能力，進(jìn)而促進(jìn)仿刺參的生長。這與蛋氨酸硒能促進(jìn)仿刺參特定生長率的結(jié)果呈正相關(guān)。

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