李霞,劉志丹,秦艷杰

(大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連 116023)

隨著冷凍保存技術的發(fā)展，人們開始探討超低溫冷凍保存對精子超微結構以及遺傳物質的損傷。林丹軍等[1]檢測了冷凍-解凍復蘇過程對大黃魚精子超微結構的影響；徐西長等[2]應用單細胞凝膠電泳技術(SCGE)研究了超低溫保存真鯛精子對其DNA的損傷。中間球海膽Strongylocentrotusintermedius作為中國北方重要的養(yǎng)殖種類，研究其精子的冷凍保存對種質資源保護、良種培育、人工育苗等具有重要意義。關于中間球海膽精子超低溫冷凍保存的研究已有一些報道[3-4]，但研究內容主要集中在抗凍劑種類、降溫方式及解凍方式的選擇等方面，對精子超低溫冷凍保存的損傷尚未見報道。本研究中，作者采用透射電鏡技術對超低溫冷凍保存前后精子的形態(tài)和超微結構進行了觀察，同時應用單細胞凝膠電泳技術研究了超低溫冷凍保存對中間球海膽精子DNA的損傷，旨在為建立中間球海膽超低溫冷凍保存技術和凍精質量的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中間球海膽取自大連新碧龍海產有限公司。于2009年5—6月和2010年9—11月分別選取性腺發(fā)育成熟的海膽，從中間球海膽圍口膜處注射0.075 mol/L KCl 1 mL，然后單個放在50 mL燒杯中，收集產出后的精子用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 冷凍精子的制備 制備冷凍精子時分為對照組(A0)和試驗組(A1)，方法如下：

試驗組(A1)：將400 μL鮮精與用400 μL消毒海水配制的抗凍劑(體積分數(shù)為10%的DMSO+體積分數(shù)為6%的甘油+25 mmol/L海藻糖)混合裝入1.8 mL凍存管中，將凍存管放入冰箱(4 ℃)內平衡10 min，取出后在液氮面上方15 cm和3 cm處分別停留3 min和5 min，再浸入液氮中冷凍保存。24 h后取出凍存管在(22±2)℃下水浴中解凍。

對照組(A0)：將400 μL鮮精與400 μL消毒海水混合，裝入1.8 mL凍存管中，冷凍、解凍方法同上。

1.2.2 電鏡樣品的制備與觀察 將新鮮精液與各組冷凍精子，分別放入用磷酸緩沖液(pH 7.2)配制的體積分數(shù)為2.5%的戊二醛中固定24 h，再用體積分數(shù)為1%的鋨酸固定2 h后，用梯度乙醇脫水，E-pon812包埋，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在JEM-1200型透射電鏡下觀察并拍照。

在電鏡下觀察各組100個精子的質膜、頂體、線粒體、鞭毛等細胞器，并計算各細胞器的畸形率：

畸形率=受損細胞器個數(shù)/總細胞器個數(shù)×100%。

1.2.3 單細胞凝膠電泳 將新鮮精液與解凍后的精液用4 ℃下預冷的磷酸緩沖液(pH 7.4)離心洗滌兩次(2 000 r/min)，然后用磷酸緩沖液將精液稀釋至106個/mL。試驗參照Singh等[5]提出的堿性單細胞凝膠電泳方法，略加改進。步驟如下：

1)凝膠片的制備。用PBS配制6.5 g/L常溫熔點瓊脂糖(NMA)溶液，于微波爐內加熱熔化，將熔解后的凝膠冷卻至45 ℃待用。取100 μL凝膠滴于預冷載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，置于冰箱(4 ℃)內保存20 min，待瓊脂糖冷卻變硬，取下蓋玻片，形成第一層凝膠；取10 μL精液與70 μL 6.5 g/L的低熔點瓊脂糖(LMA)溶液混勻，制成精子LMA懸液，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4 ℃下放置20 min使LMA硬化，輕輕取下蓋玻片，形成第二層凝膠；隨后在其上滴加75 μL 6.5 g/L LMA，加蓋玻片，形成第三層膠，凝固后取下蓋玻片。

2)裂解。將鋪好膠的載玻片立即浸入預冷的裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，調節(jié)pH至10后加入10 g/L肌氨酸鈉，臨用前加入體積分數(shù)為1%的TritonX-100和體積分數(shù)為10%的DMSO)中，于4 ℃下裂解1 h。

3)電泳。將上述處理的玻片，吸去表面液體。并列放置在水平電泳槽的陽極，然后加入預冷的堿性電泳液(300 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2EDTA，pH>13)，液面高出玻片約2.5 mm，浸泡30 min，使DNA雙鏈充分解旋， 之后在25 V、300 mA條件下，避光電泳40 min。

4)觀察并拍照。取出載玻片吸干水分，用Tris-HCl(0.4 mol/L，pH 7.5)中和3次，每次5 min；隨后滴加50 μL EB(50 μg/mL)溶液，加上蓋玻片染色15 min；避光操作，在熒光顯微鏡(Nikon DXM 1200)下觀察并拍照。

5)圖像分析及數(shù)據處理。采用CASP彗星圖像分析軟件測量。根據彗星尾部的DNA含量將DNA損傷程度分為5級：0級(G0)，DNA含量<5%，無損傷，精子核完整；1級(G1)，DNA含量為5%～20%，輕度損傷，可見彗尾，精子核基本完整；2級(G2)，DNA含量為20%～40%，中度損傷，可見明顯的彗尾，精子核縮?。?級(G3)，DNA含量為40%～95%，重度損傷，彗尾熒光信號強而密，并見明顯縮小的精子核；4級(G4)，DNA含量>95%，完全損傷，僅見熒光強而密的彗星，精子核基本消失。每次計數(shù)100個精子，重復3次，計算各級損傷率[6]以及彗星率:

彗星率=彗星細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，

損傷系數(shù)=∑(Gi級損傷細胞數(shù)×i),i=0～4。

1.3 數(shù)據處理

用SPSS 17.0軟件處理試驗數(shù)據，采用One Way-ANOVA做單因素方差分析, 差異顯著性水平設為0.05。試驗數(shù)據用平均數(shù)±標準差表示。

2 結果

2.1 正常中間球海膽的精子形態(tài)

在透射電鏡下觀察新鮮精子的超微結構時發(fā)現(xiàn)，中間球海膽精子屬鞭毛型，由頭和尾組成。精子頭部形似“子彈頭”，緊緊包被于平滑的質膜下，頭部主要由頂體和細胞核組成。頂體位于前端，呈圓錐狀，前端鈍圓，內含電子密度較高的物質；細胞核由前到后逐漸變寬，電子密度很高，細胞核外有一層核膜，正常狀態(tài)下核膜和質膜不易區(qū)分；核的上端為頂體窩，呈“U”型，窩內物質電子密度較低，排列疏松(圖1-a)；核后窩位于核的下端，呈倒“V”字型(圖1-b)；線粒體數(shù)目為1個，形態(tài)較大，位于細胞核的后方，近圓形，具有雙層膜結構，內膜向內折形成排列不規(guī)則的內嵴(圖1-c)。鞭毛從核后窩內伸出，由軸絲和鞘組成，橫切面可見軸絲為典型的“9+2”型結構(圖1-d)。

2.2 冷凍后中間球海膽精子的形態(tài)變化

觀察發(fā)現(xiàn)，A0組精子線粒體和頂體結構均不完整，質膜、鞭毛破損，細胞核裸露(圖1-e)。A1組多數(shù)精子結構完好，但有部分精子的細胞器受損，表現(xiàn)為質膜褶皺(圖1-f)，或膨脹舉起，與核膜間隙明顯增大(圖1-g)；頂體腫脹、破裂(圖1-h)或脫落(圖1-i)；線粒體嵴間隙增大，內部出現(xiàn)空泡(圖1-j)，甚至線粒體內膜破損，內嵴減少，呈彌散狀(圖1-k)；鞭毛被膜腫脹，呈波浪狀，“9+2”型結構模糊(圖1-l)。細胞核結構同新鮮精子。各組細胞器畸形率見表1。由表1可見，冷凍對質膜和線粒體結構影響較大，對頂體次之。

圖1 中間球海膽新鮮精子和冷凍精子超微結構的比較Fig.1 Ultrastructural comparison of fresh and post-thawed sperm in sea urchin Strongylocentrotus intermedius

注：a～d 正常鮮精子的亞顯微結構；e A0組冷凍精子，示細胞核裸露； f A1組冷凍精子，示質膜褶皺；g A1組冷凍精子，示質膜高度膨脹；h A1組冷凍精子，示頂體腫脹變形；i A1組冷凍精子，示頂體脫落；j A1組線粒體，示內嵴間隙增大；k A1組線粒體，示線粒體內膜解體；l A1組冷凍精子鞭毛縱切，鞭毛外膜腫脹，呈波浪狀。Ac示頂體；N示細胞核；M示線粒體；AF示頂體窩(核前窩)；SS示亞頂體腔；PF示核后窩；F示鞭毛；PM示質膜。

Note:a-d Ultrastructure of normal fresh sperm; e Post-thawed sperm in group A0, showing nucleus exposure; f Post-thawed sperm in group A1, showing the swollen plasma membrane; g Post-thawed sperm in group A1, showing swollen plasma membrane;h Post-thawed sperm in group A1, showing the swollen acrosome;i Post-thawed sperm in group A1, showing detachment of acrosome;j Mitochondria in group A1, showing enlargement of mitochondrion cristae space; k Mitochondria in group A1, showing disruption of the external membrane of mitochondrion;l Cross section of flagellum of post-thawed sperm in group A1, showing swolled membrane of flagellum.Ac,acrosome; N,nucleus; M,mitochondria; AF,acrosome fossa; SS,subacrosomal space；PF, posterior nuclear fossa; F,flagellum; PM,plasma membrane.

表1 冷凍前后精子細胞器畸形率的變化

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。

Note:The means with the different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level.

2.3 凍存精子DNA損傷的檢測

用SCGE檢測不同冷凍保護液保存精子后，冷凍精子DNA有不同程度的損傷(表2)。DNA彗星圖見圖2。

由表2可見，A0組、A1組精子解凍后各級損傷情況、彗星率以及損傷系數(shù)與鮮精均無顯著差異(P>0.05)。冷凍精子DNA損傷主要為輕度和中度損傷，重度損傷比率較低，而完全損傷則未發(fā)現(xiàn)。

表2用SCGE檢測中間球海膽鮮精及凍存精子的DNA損傷分級(n=100)

Tab.2C1assificationofDNAdamagedetectioninfleshandfrozen-thawedspermintheseaurchinbySCGE(n=100)

%

圖2 中間球海膽精子SCGE彗星圖Fig.2 Comet image of the sea urchin sperm through SCGE

注：A DNA 0級損傷；B DNA 1級損傷；C DNA 2級損傷；D DNA 3級損傷。

Note:A Damage grade 0 in DNA;B Damage grade 1 in DNA;C Damage grade 2 in DNA;D Damage grade 3 in DNA.

3 討論

3.1 冷凍對精子結構損傷和功能的影響

精子冷凍過程中細胞內外冰晶的形成以及細胞內電解質或大分子物質的濃縮(如蛋白質等)是造成冷凍損傷的主要因素。細胞內外環(huán)境存在一定水分，冷凍時溫度降低會形成冰晶，使細胞器受到機械損傷。同時由于細胞外溶液濃度增加引起細胞嚴重脫水，胞內物質濃縮，或者膜破損，胞內物質丟失，細胞器結構發(fā)生改變[7]。DMSO、甘油等滲透型保護劑可以增強細胞膜的通透性，能夠滲入細胞內部，與細胞內的水分子結合，使得溶液黏性增加，從而弱化水的結晶，減少冰晶對精子的損傷。所以添加抗凍劑一組冷凍精子的質膜、頂體、線粒體、鞭毛等細胞器畸形率較不添加組顯著下降。

用透射電鏡觀察冷凍前后精子的超微結構,結果表明，添加抗凍劑后雖有多數(shù)精子結構完好，但仍有部分精子的細胞器受損，表現(xiàn)為質膜膨脹舉起,嵴間隙增大，內部出現(xiàn)空泡。頂體破裂或脫落，鞭毛被膜腫脹，呈波浪狀，“9+2”型結構模糊，表現(xiàn)形式的不同和精子個體間的差異有關。損傷特征與西伯利亞鱘[8]、太平洋牡蠣[9]精子凍存的研究結果相似。細胞器結構與精子行使正常生理功能密切相關，如質膜具有維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定以及接受外界刺激的作用；線粒體是精子能量的來源，它為精子的新陳代謝和運動提供能量。Gwo[10]對運動前后精子的線粒體觀察后發(fā)現(xiàn)，運動后線粒體體積變小，數(shù)目也迅速減少，最后完全消失。頂體是精子行使受精功能必不可少的細胞器,頂體變形以及破裂將使得精子不能正常受精。楊培民[11]認為，頂體破裂將導致無法識別精卵。精子靠鞭毛的擺動進行運動,鞭毛的畸變也會影響精子的運動能力，使得其進入卵子的幾率降低。細胞器受損后必然導致解凍后精子喪失運動能力，不能完成正常受精。

3.2 冷凍和抗凍劑對DNA損傷的影響

精子細胞核是遺傳物質的載體，而DNA作為遺傳物質，其完整性對于物種的延續(xù)具有重要意義。關于冷凍對精子DNA損傷目前有兩種觀點：一種觀點認為，冰凍對精子DNA沒有影響，精子作為單倍體細胞，其染色質結構與體細胞不同，由魚精蛋白濃縮形成超螺旋四聚體，染色質高度凝聚，細胞內液體成分極少，不會形成冰晶，可以采用冰凍方式保存精子DNA[12]；第二種觀點認為，冷凍會造成DNA損傷，精子在從精原細胞逐漸轉化為精子的過程中, 在后期丟失了大部分的細胞質, 從而也就遺失了一部分保護精子細胞免遭氧化損傷的酶類, 而這些酶有利于組蛋白向魚精蛋白的轉化[13]。有學者認為，高濃度的抗凍劑可引起精子DNA損傷。魏平等[14]檢測了不同濃度的DMSO對真鯛Pagrosomusmajor精子DNA的損傷，認為用體積分數(shù)為5%～25%DMSO組成的抗凍劑冷凍精子，解凍后DNA的損傷狀況與鮮精接近，但DMSO的體積分數(shù)高于25%時，真鯛冷凍精子DNA的損傷比鮮精顯著加重。陳東華等[15]認為，體積分數(shù)為10%的DMSO抗凍劑對河蟹Eriocheirsinensis精子DNA的損傷最為明顯。本試驗結果表明：冷凍以及添加較低濃度的抗凍劑對中間球海膽精子DNA損傷均沒有顯著影響，說明適宜的抗凍劑種類和濃度能夠對精子DNA起到較好的保護效果，高濃度的抗凍劑對DNA結構是否有影響還有待進一步研究。

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