馬 麗蓋利剛李 寧李 梅

(1.山東輕工業(yè)學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.青島寶博生物科技有限公司，山東青島 266100)

在動(dòng)物飼料和預(yù)混料產(chǎn)品中，羥基蛋氨酸可以等摩爾地轉(zhuǎn)變成L-蛋氨酸；換言之，等摩爾的羥基蛋氨酸和D,L-蛋氨酸具有相同的生物學(xué)效價(jià)[1-2]。蛋氨酸是動(dòng)物生長發(fā)育所必需的氨基酸，動(dòng)物缺乏蛋氨酸會(huì)引起發(fā)育不良、體重減輕、肝腎機(jī)能減弱、肌肉萎縮、皮毛變質(zhì)等[2-3]。鈷是動(dòng)物體內(nèi)所必需的微量元素，是維生素B12極其重要的組成成分；鈷可影響甲狀腺代謝，能參與膽堿、蛋氨酸等的合成及脂肪與糖的代謝；鈷還與其它微量元素（如鋅、銅、錳等元素）有協(xié)同作用，能促進(jìn)這些微量元素在動(dòng)物體內(nèi)的吸收[4-5]。鈷作為中心離子能與羥基蛋氨酸螯合成羥基蛋氨酸鈷，但這種新型的有機(jī)微量元素添加劑到目前為止鮮有報(bào)道[6-7]。

近來，我們實(shí)驗(yàn)室以價(jià)廉、低毒的醇水溶液為介質(zhì)，以市售羥基蛋氨酸和氫氧化鈷為原料，制得了羥基蛋氨酸鈷，并對其進(jìn)行了物相分析、形貌觀測、表面元素分析及熱穩(wěn)定性考察[8]。有機(jī)微量元素螯合物的配位數(shù)和穩(wěn)定常數(shù)是影響其生物學(xué)利用率的重要指標(biāo)[9]，能夠?yàn)榕浜衔锝Y(jié)構(gòu)的確定提供重要的信息；但是，由于羥基蛋氨酸微量元素螯合物的單晶很難培養(yǎng)，關(guān)于羥基蛋氨酸螯合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)到目前為止還沒有可靠的數(shù)據(jù)，只能靠推測。本文采用分光光度法測定了羥基蛋氨酸鈷樣品的配位數(shù)和穩(wěn)定常數(shù)，為合理推測其結(jié)構(gòu)及評價(jià)其穩(wěn)定性提供了依據(jù)。其次，采用自動(dòng)電位滴定分析儀測定了樣品中羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷的含量，對樣品的質(zhì)量進(jìn)行了評價(jià)。本文的研究旨在為市場上同類產(chǎn)品的質(zhì)量評價(jià)提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

化學(xué)試劑：氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、六水合氯化鈷(Ⅱ)、冰乙酸、濃鹽酸(36%～38%)、五水合硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、重鉻酸鉀、碘化鉀、濃硫酸、可溶性淀粉、溴酸鉀、溴化鉀、酚酞，以上試劑均為分析純。市售88%的羥基蛋氨酸（MHA）由日本住友化學(xué)有限公司北方辦事處提供。

實(shí)驗(yàn)儀器：KQ-700E型超聲波清洗器（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），ZDJ-4A型自動(dòng)電位滴定儀（上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司生產(chǎn)），81-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司生產(chǎn)），DZF-6050型真空干燥箱（上海凱朗儀器設(shè)備廠生產(chǎn)），ESJ210-4A電子天平（上海先悅衡器設(shè)備有限公司生產(chǎn)），UV754A型紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

1.2.1 羥基蛋氨酸鈷穩(wěn)定常數(shù)的測定

采用等摩爾數(shù)連續(xù)變化法（也叫濃比遞變法或Job法）測定羥基蛋氨酸鈷樣品的穩(wěn)定常數(shù)[10]。在保持溶液中金屬離子濃度(cM)與配體濃度(cL)之和不變的前提下，改變cM和cL的相對量，配制一系列溶液。只有當(dāng)溶液中金屬離子與配體物質(zhì)的量之比與配合物的組成一致時(shí)，配合物的濃度最大。用分光光度計(jì)測定上述一系列溶液的吸光值，以吸光值(A)為縱坐標(biāo)，以摩爾分?jǐn)?shù)(F)為橫坐標(biāo)作圖，得吸光曲線。將曲線兩邊的直線部分延長相交，根據(jù)交點(diǎn)對應(yīng)的橫坐標(biāo)值即可求出配合物MLn中配位體的數(shù)目n。

根據(jù)配合物離解平衡方程式（MLn=M+nL）和配合物的離解度(α)可確定表觀穩(wěn)定常數(shù)

1.2.2 羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷含量的測定

利用溴酸鉀-溴化鉀法[2,10-11]測定樣品中羥基蛋氨酸的含量，并進(jìn)而計(jì)算出樣品中羥基蛋氨酸鈷的含量。在酸性介質(zhì)中，羥基蛋氨酸鈷分解形成鈷離子和羥基蛋氨酸陰離子。羥基蛋氨酸陰離子和溴酸鉀-溴化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)生如下反應(yīng),見式(1)和(2)：

進(jìn)行電位滴定時(shí)，在待測液中插入一根鉑和飽和甘汞電極組成的復(fù)合電極。隨著KBrO3/KBr滴定液的加入，待測組分濃度不斷變化，電極電位也發(fā)生相應(yīng)的變化，在等電點(diǎn)附近發(fā)生電位突躍，以此確定滴定終點(diǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 羥基蛋氨酸鈷穩(wěn)定常數(shù)的測定

1.3.1.1 羥基蛋氨酸水溶液的標(biāo)定

稱取約 8.6 g（精確至0.1 mg）市售羥基蛋氨酸，并將之全部轉(zhuǎn)移至1 000 ml容量瓶中，用除去CO2的蒸餾水稀釋、定容、搖勻；移取50 ml羥基蛋氨酸水溶液，加入2滴1%的酚酞指示劑，用按國標(biāo)GB/T 601—2002規(guī)定的方法標(biāo)定的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.091 8 mol/l)滴定至溶液由無色變?yōu)榉奂t色，并在30 s內(nèi)不褪色。平行滴定三次并做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.2 吸光值的測定

配制與步驟1中羥基蛋氨酸水溶液濃度相同的氯化鈷(Ⅱ)水溶液。按表1所示的體積比配制一系列混合溶液，分別用步驟1中的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)溶液的pH值約為6.5，然后稀釋至60 ml；在85°C將混合溶液加熱回流2 h，冷卻至室溫，測其290 nm處的吸光值。

1.3.2 羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷含量的測定

按國標(biāo)GB/T 21034—2007規(guī)定的方法測定。稱取約0.5 g（精確至0.1 mg）干燥的羥基蛋氨酸鈷樣品，置于100 ml燒杯中，加入50 ml混酸溶液(冰乙酸：水：濃鹽酸=50：10：3，體積比)，超聲溶解后將燒杯置于磁力攪拌器上。將電極插入溶液中，調(diào)節(jié)攪拌速率至溶液平穩(wěn)渦旋，用按國標(biāo)GB/T 601—2002規(guī)定的方法標(biāo)定的溴酸鉀-溴化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.105 1 mol/l）滴定。當(dāng)電位出現(xiàn)變化時(shí)，減慢滴定速率，當(dāng)電位值發(fā)生突躍時(shí)，即為滴定終點(diǎn)，記錄滴定溶液的體積。平行滴定三次。

3 結(jié)果與討論

3.1 羥基蛋氨酸鈷配位數(shù)及穩(wěn)定常數(shù)的確定

經(jīng)測定，羥基蛋氨酸水溶液的濃度為0.044 3 mol/l；因此，準(zhǔn)確稱取1.581 0 g六水合氯化鈷(II)，并將之溶解于150 ml除去CO2的蒸餾水中，以使配體溶液的濃度和金屬離子溶液的濃度相等。對序號為5的溶液進(jìn)行全波長掃描(200～800 nm)，確定出最佳吸收峰出現(xiàn)在290 nm處，依次對所有溶液進(jìn)行290 nm的單波長掃描，記錄不同體積分?jǐn)?shù)溶液的吸光值(見表1)。以吸光值為縱坐標(biāo)，溶液中金屬離子的摩爾分?jǐn)?shù){c(M)/[c(M)+c(L)]}為橫坐標(biāo)作圖，得吸光曲線圖(見圖1)。

表1 配合物溶液配制及吸光值

由圖1可以看出，吸光曲線兩邊直線部分延長相交于B點(diǎn)，B點(diǎn)對應(yīng)金屬離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.355，即：c(M)/[c(M)+c(L)]=0.355，則：c(L)/c(M)=1.82≈ 2?？紤]到羥基蛋氨酸根離子中α-羥基和羧酸根中的氧可與鈷(II)離子形成穩(wěn)定的五元環(huán)螯合物，則羥基蛋氨酸鈷螯合物的配位數(shù)為4，這說明我們所推測的羥基蛋氨酸鈷的結(jié)構(gòu)式是合理的[8]。

直線BC與吸光曲線相交于D點(diǎn)，由此可確定配合物的離解度α=(0.293-0.259)/0.293=0.116。B點(diǎn)對應(yīng)的配合物濃度c=0.0443×0.355×20/60=5.24×10-3mol/l，則配合物的表觀穩(wěn)定常數(shù)為[(2×5.24×10-3)1.82×0.1162.82]=4.71×105.46。

配合物穩(wěn)定常數(shù)測定的儀器分析方法主要有電化學(xué)法、分光光度法、色譜法和毛細(xì)管電泳法等，各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。其中，分光光度法和電位法相比，雖然準(zhǔn)確性較差，但具有操作方便、檢測迅速、溶液選擇的范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[12]。雖然羥基蛋氨酸鈷在蒸餾水中的溶解度較小，室溫下約為0.8 g；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只要控制配合物溶液的濃度小于2.24×10-2mol/l，采用分光光度法測定羥基蛋氨鈷螯合物的穩(wěn)定常數(shù)是可行的。

3.2 羥基蛋氨酸和羥基蛋氨酸鈷含量的測定

表2是采用自動(dòng)電位滴定儀測定的羥基蛋氨酸鈷樣品中MHA含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表。根據(jù)反應(yīng)式(1)和(2)可以確定樣品中MHA的質(zhì)量百分含量其中，c為KBrO3-KBr標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(0.105 1 mol/l)，M1為羥基蛋氨酸的摩爾質(zhì)量(150.2)。由表2可見，樣品中MHA的平均質(zhì)量百分含量為83.20%，且偏差均小于0.5%，說明采用溶劑熱法所制備的羥基蛋氨酸鈷遠(yuǎn)比采用水熱法所得的產(chǎn)物質(zhì)量高[8,13]。

表2 樣品中羥基蛋氨酸含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3是樣品中羥基蛋氨酸鈷含量實(shí)驗(yàn)測定數(shù)據(jù)表。根據(jù)反應(yīng)式(1)和(2)及上述羥基蛋氨酸鈷配位數(shù)的計(jì)算結(jié)果，可以確定樣品中羥基蛋氨酸鈷的質(zhì)量百分含量，其中，M2為羥基蛋氨酸鈷的摩爾質(zhì)量(357.33)。由表3可見，樣品中羥基蛋氨酸鈷的平均含量高達(dá)98.97%，且各種偏差均小于0.5%。結(jié)合表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，充分說明采用溶劑熱法能夠制得高質(zhì)量的羥基蛋氨酸鈷。

表3 樣品中羥基蛋氨酸鈷含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

4 結(jié)論

采用分光光度法測定了羥基蛋氨酸鈷樣品的表觀穩(wěn)定常數(shù)，采用自動(dòng)電位滴定法測定了樣品中羥基蛋氨酸及羥基蛋氨酸鈷的含量。研究結(jié)果表明：羥基蛋氨酸鈷樣品的表觀穩(wěn)定常數(shù)為4.71×105.46，樣品中羥基蛋氨酸的含量為83.20%，羥基蛋氨酸鈷的含量為98.97%，結(jié)合分光光度法和自動(dòng)電位滴定法對羥基蛋氨酸類似物進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，方法簡單，操作方便，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差小、重現(xiàn)性好，可以作為同類產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)日常質(zhì)量檢驗(yàn)的技術(shù)參考。

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