何海燕張 健覃擁靈

(1.河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州 546300；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530021)

優(yōu)質(zhì)蛋白飼料的缺乏是目前養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)面臨的難題之一，它直接限制了養(yǎng)殖業(yè)及畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，由于資源和環(huán)境的限制，開發(fā)利用非食用資源、廢棄資源和低消化性飼料通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)是解決蛋白質(zhì)飼料短缺問(wèn)題的有效途徑,因而開發(fā)和利用各種潛在的飼料資源對(duì)發(fā)展我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)具有十分重要的意義[1-4]。玉米是我國(guó)主要的農(nóng)作物之一,玉米苞葉，也稱玉米苞皮，是玉米果穗外部的包被部分，含有大量的纖維素、一定量的總黃酮、淀粉及其它多糖、單糖等成分，可作為微生物發(fā)酵原料生產(chǎn)生物飼料，玉米苞葉來(lái)源廣，價(jià)格低廉，研究玉米苞葉混菌發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料具有一定的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益[5-8]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、綠色木霉（Trichoderma viride），實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 斜面培養(yǎng)基：參照周德慶（2006）[9]配制。

酵母種子培養(yǎng)基:葡萄糖2 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g，補(bǔ)充蒸餾水至 100 ml，pH 值 5.5。

固體培養(yǎng)基：粉碎玉米苞葉1 000 g，另加入K2HPO45 g、(NH4)2SO410 g、7H2O·MgSO410 g、尿素 20 g、料水比為1：1，然后進(jìn)行拌料并裝瓶，裝瓶后高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化無(wú)菌條件下接一環(huán)保藏菌種至PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，復(fù)蘇菌種。

1.2.2 酵母種子擴(kuò)大培養(yǎng)取一環(huán)活化后的酵母斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝液量20 ml/100 ml的種子培養(yǎng)基，28℃、180 r/min培養(yǎng)36 h。

1.2.3 固體發(fā)酵滅菌固體培養(yǎng)基冷卻后接入約1 cm×1 cm纖維素分解真菌斜面培養(yǎng)物,用無(wú)菌玻棒將菌種與培養(yǎng)基混勻,30℃發(fā)酵一定時(shí)間后接入酵母,接種量為10%,進(jìn)行混合菌種發(fā)酵。

1.2.4 測(cè)定方法發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定[8]。

1.2.5 菌種篩選產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母與米曲霉、黑曲霉、綠色木霉分別組合混菌發(fā)酵,考察最優(yōu)組合進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)在菌種篩選的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)蛋白飼料生產(chǎn)發(fā)酵條件影響較大的因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)酵條件對(duì)已篩選最優(yōu)混菌組合發(fā)酵的影響。

2 結(jié)果及分析

2.1 菌種篩選

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1：發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量最高的菌種組合為啤酒酵母和綠色木霉混菌發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量達(dá)15.43%,是發(fā)酵前蛋白含量5.23%的2.95倍,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)纖維素降解真菌與酵母的協(xié)同作用，能有效地把原發(fā)酵材料中生物利用率較低的纖維素轉(zhuǎn)化為菌體自身的蛋白質(zhì)，從而有效增加了發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白含量，使發(fā)酵產(chǎn)物的飼用價(jià)值得到較大幅度提升。

表1 不同混菌組合發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的對(duì)比

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

選取單菌培養(yǎng)溫度、單菌培養(yǎng)時(shí)間、混菌發(fā)酵溫度、混菌發(fā)酵時(shí)間及酵母接種量5個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，采用L16（45）的正交設(shè)計(jì)方法（見(jiàn)表2）研究啤酒酵母與綠色木霉最優(yōu)化發(fā)酵條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2L16（45）正交實(shí)驗(yàn)

表3L16（45）正交實(shí)驗(yàn)直觀分析

由表 3 可知，極值 RA＞RD＞RB＞RC＞RE，即單菌培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的影響最為顯著，然后依次為混菌發(fā)酵時(shí)間、單菌培養(yǎng)時(shí)間、混菌發(fā)酵溫度，最不顯著的因子為接種量。啤酒酵母和綠色木霉混菌發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件組合為A3B3C3D4E2即單菌培養(yǎng)溫度30℃，單菌培養(yǎng)時(shí)間60 h，混菌發(fā)酵溫度30℃，混菌發(fā)酵時(shí)間84 h，酵母接種量12%。由于在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中沒(méi)有符合此發(fā)酵條件的方案，后繼實(shí)驗(yàn)按照上述得出的最佳發(fā)酵條件做追加實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(均值)與初始培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)比見(jiàn)表4。

表4 初始條件與最優(yōu)培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量對(duì)比

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,在實(shí)驗(yàn)確定的最佳優(yōu)化條件下,發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量達(dá)24.11%，比優(yōu)化前的15.43%提高了8.68個(gè)百分點(diǎn)。

3 結(jié)論

以玉米苞葉為原料發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白含量生物飼料，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量可達(dá)到24.11%，可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料。實(shí)驗(yàn)通過(guò)菌種篩選，得到最優(yōu)混菌發(fā)酵組合進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量得到了較大幅度提高，廉價(jià)的農(nóng)業(yè)廢棄物玉米苞葉可以作為發(fā)酵原料生產(chǎn)高蛋白含量的優(yōu)質(zhì)生物飼料。

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