劉婷婷，朱文增，金 弘，黃日龍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040;2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;4.安徽省中醫(yī)院，安徽合肥230031)

頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠腦組織AQP4表達的影響*

劉婷婷1，朱文增2△，金 弘3，黃日龍4

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040;2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;4.安徽省中醫(yī)院，安徽合肥230031)

目的:研究頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用機制。方法:采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。將Wistar雄性大鼠，隨機分成3組:假手術(shù)組、模型組、頭穴叢刺組。各組隨機分成6 h、1 d、2 d、3 d共5個時間點，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測大鼠腦缺血再灌注后AQP4蛋白表達變化及頭穴叢刺法治療對它們的影響。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示與模型組比較，頭穴叢刺組損傷側(cè)腦組織AQP4蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:頭穴叢刺法能夠調(diào)節(jié)AQP4的表達，減輕由于再灌注損傷導(dǎo)致的血腦屏障通透性增強，從而減輕腦水腫，在腦缺血再灌注早期起到挽救和保護受損神經(jīng)元、改善神經(jīng)功能的治療作用。

腦缺血再灌注;頭穴叢刺法;腦水腫;水通道蛋白－4

缺血性腦血管病以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率嚴重影響著人們的健康?；謴?fù)缺血腦組織的血流灌注是治療腦缺血的前提，但再灌注過程中會繼發(fā)多種腦組織損傷。經(jīng)過多年的研究，針刺在治療腦缺血急性期和后遺癥神經(jīng)元保護方面取得了重要進展，頭穴叢刺法治療在臨床上取得極好的療效。本研究擬從分子水平探討頭穴叢刺法對腦缺血再灌注損傷后血腦屏障功能恢復(fù)和腦水腫的防治機制，證實頭穴叢刺法在改善神經(jīng)功能、促進神經(jīng)再生、血腦屏障修復(fù)和功能重建等方面的優(yōu)勢，為臨床上進一步采用頭穴叢刺法治療腦梗死提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性清潔級Wistar大鼠180只，體質(zhì)量(250± 20)g，鼠齡4～5個月，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(動物生產(chǎn)許可證編號:黑動字第P00102008)。大鼠自由進食、飲水，同等條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，手術(shù)前12 h禁食不禁水。按隨機數(shù)字表法將動物隨機分成3組:假手術(shù)組、缺血再灌注模型組(以下簡稱模型組)、缺血再灌注后頭穴叢刺治療組(以下簡稱頭針組)。各組隨機分成6 h、1 d、2 d、3 d、5 d共5個時間點，每個時間點12只動物。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備

采用改良的Zea Longa法［1，2］制作右側(cè)大腦中動脈阻塞(腦缺血)再灌注模型。

栓線制備［3］:把直徑0.234 mm的日本產(chǎn)釣魚用尼龍線(日本漁具株式會社)切割成長約5.0 cm的小線段，將其一端快速閃過火焰燒制成光滑球形，選用表面光滑、斷面平直及球體直徑約為0.25 mm的線栓，在離球端3 cm處標(biāo)記，75%酒精清潔處理，浸泡于125 mg/dl肝素生理鹽水中，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

模型制備過程:10%水合氯醛35 mg/kg腹腔麻醉，頸部正中切口，自胸骨角到距離鼠下唇1.0 cm處，剝離暴露右側(cè)頸總動脈1～1.5 cm，近心端絲線結(jié)扎，并結(jié)扎右側(cè)頸外動脈。頸總動脈切口，栓線插入18～20 mm，將栓線經(jīng)頸內(nèi)動脈送至大腦中動脈起始處，逐層縫合。腦缺血2 h后，輕輕回撤栓線，實現(xiàn)腦缺血再灌注。術(shù)中及術(shù)后維持動物肛溫在(37±1)℃，術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2.2 取穴及針刺方法

參照《實驗針灸學(xué)》［4］取大鼠的百會穴和百會穴左右旁開2 mm共3個穴位。

假手術(shù)組:手術(shù)時把尼龍栓線僅插入頸總動脈6 mm左右而不入顱;術(shù)后不給予任何治療。

模型組:造模后，不給予任何治療。

頭針組:待動物評分后開始給予頭穴叢刺治療，每日針刺1次，用0.35 mm×25 mm毫針從后向前平刺大約6～8 mm，每次留針30 min，每15 min捻針1次，頻率為200轉(zhuǎn)/min左右，每次持續(xù)捻轉(zhuǎn)3 min。

1.3 觀察項目及方法

1.3.1 動物神經(jīng)系統(tǒng)體征的觀察與評分標(biāo)準(zhǔn)

參照Zea Longa的5級評分標(biāo)準(zhǔn)［1］，所有動物再灌注完成后6 h，進行第1次神經(jīng)功能缺損評分，以后分別于再灌注后1 d、2 d、3 d、5 d時進行神經(jīng)功能評分。0分:無神經(jīng)缺損癥狀，活動正常;1分:不能完全伸展左側(cè)前肢，輕度局灶性神經(jīng)功能缺失;2分:行走時身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度局灶性神經(jīng)功能缺失;3分:行走時身體向左側(cè)傾倒，重度局灶性神經(jīng)功能缺失;4分:不能自發(fā)行走，意識水平喪失。

造模后對其進行初選，保留神經(jīng)功能評分在1～3分的大鼠。造模及針刺過程中死亡的大鼠予以剔除，按隨機數(shù)字表補入。密切觀察造模大鼠的各項體征，詳細記錄。

1.3.2 免疫組化法檢測AQP4蛋白的表達

AQP4在星形膠質(zhì)細胞及血管周圍呈棕黃色為陽性表達。免疫組化染色切片圖像結(jié)果分析方法:采用Motic Med6.0圖像分析系統(tǒng)，每組選6張切片，利用顯微攝像系統(tǒng)，每張切片在400倍下隨機選取缺血區(qū)5個非重疊視野，AQP4計算陽性顯色的面積百分比，取其平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 實驗各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

見表1。模型組在2 d時神經(jīng)功能缺損評分顯著高于6 h、1 d(P=0.001，0.041＜0.05)，隨后開始下降，在5 d時明顯優(yōu)于2 d評分，具有顯著性差異(P= 0.001＜0.05)，但與3 d、6 h差異不顯著。可見在缺血再灌注6 h～2 d，神經(jīng)功能缺損有所加重，隨著缺血時間的延長，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損在一定程度上存在著自發(fā)性恢復(fù)的趨勢。頭針組在3 d時神經(jīng)功能缺損評分明顯減少，與2 d、1 d時比較，具有顯著性差異(P=0.001，0.047＜0.05)，但與6 h比較，無顯著性差異(P=0.370＞0.05)，至5 d時評分減少程度更明顯，分別優(yōu)于6 h、1 d、2 d、3 d(P=0.003，0.001，0.001，0.001＜0.05)。

與假手術(shù)組比較，大鼠腦缺血再灌注后不同時間點模型組、頭針組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，兩兩比較具有顯著性差異(P＜0.05);頭針組在術(shù)后6 h、1 d、2 d與模型組比較無顯著性差異(P=0.294，0.533，0.264＞0.05)，3 d、5 d時均可見神經(jīng)功能缺損評分減少，頭針組明顯優(yōu)于模型組，具有顯著性差異(P=0.003，0.001＜0.05)。說明頭穴叢刺法能夠促進腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2 頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4表達的影響

見表2。假手術(shù)組大鼠AQP4主要在皮層、皮層下白質(zhì)及紋狀體區(qū)的毛細血管壁、膠質(zhì)細胞的胞膜表達，而在神經(jīng)元則未見表達。模型組AQP4表達隨時間的推移而發(fā)生一定變化，在1 d時降至最低，隨后逐漸回升，個別大鼠在海馬錐體細胞層出現(xiàn)陽性表達。頭針組也可見AQP4表達，與假手術(shù)組較為接近。

模型組在6 h缺血側(cè)腦組織中AQP4表達有所下降，1 d時缺血側(cè)腦組織中AQP4表達降至最低，與6 h時比較，具有顯著性差異(P=0.001＜0.05);從2 d開始逐漸恢復(fù)，3 d時腦組織中AQP4表達明顯高于1 d (P=0.001＜0.05);5 d時腦組織中AQP4表達繼續(xù)回升，接近正常數(shù)值，但顯著高于1 d(P=0.001＜0.05)，且與3 d相比，有顯著性差異(P=0.001＜0.05)。

與假手術(shù)組比較，大鼠腦缺血再灌注后6 h、1 d、2 d、3 d模型組AQP4表達均出現(xiàn)不同程度的改變，兩兩比較具有顯著性差異(P＜0.05);頭針組在再灌注后6 h與模型組比較無顯著性差異(P=0.275＞0.05)，1 d、2 d、3 d、5 d時頭針組AQP4表達雖有明顯回升，但1 d、2 d、3 d、5 d時AQP4表達明顯低于同時間點模型組，具有顯著性差異(P=0.035，0.049，0.007，0.001＜0.05)。

表1 實驗各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 (±s)

表1 實驗各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 (±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手術(shù)組組別 例數(shù)120 0 0 0 0模型組 12 1.83±0.49*2.29±0.39*2.67±0.33*2.25±0.40*1.96±0.54*頭針組 12 1.67±0.44*2.21±0.40*2.54±0.33*1.83±0.39＊△1.08±0.63＊▲

表2 頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4表達的影響 (%，±s)

表2 頭穴叢刺法對腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4表達的影響 (%，±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手術(shù)組 6 7.43±0.54 7.53±0.44 7.55±0.59 7.57±0.62 7.組別 n 51±0.65模型組 6 5.56±0.56*3.89±0.55*4.33±0.42*5.94±0.63*7.35±0.53頭針組 6 5.40±0.54*3.61±0.53＊△4.08±0.40＊△5.53±0.49＊▲5.71±0.47＊▲

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白(aquaporin，AQP)家族中的AQP4可介導(dǎo)水跨膜的雙向運動，參與血漿滲透壓的調(diào)節(jié)、血腦屏障的發(fā)育和功能維系，并兼有細胞外滲透壓感受器的功能，對維持腦內(nèi)水平衡至關(guān)重要，與腦水腫有著密切的關(guān)系［5～6］。

本研究發(fā)現(xiàn)的AQP4水平或活性主動降低正是機體從微觀上對腦水腫和血腦屏障損傷的一種保護性反應(yīng)。其可能的作用機制是:缺血再灌注損傷后，細胞間隙中增高的K+、H+以及以谷氨酰胺為首的一系列興奮性氨基酸濃度上升，由此刺激膠質(zhì)細胞啟動激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)［7］，并導(dǎo)致蛋白激酶 C活性升高［8］，激活的蛋白激酶C對AQP4進行磷酸化反應(yīng)，AQP4經(jīng)磷酸化后其生物活性喪失［9～11］，從而在一定程度上減少經(jīng)由破壞的血腦屏障進入腦組織細胞間隙以及經(jīng)膠質(zhì)細胞膜進入細胞內(nèi)的水分子的量，從而達到減緩腦水腫的目的。但是當(dāng)局部區(qū)域的各種有害物質(zhì)逐漸增多，細胞外間隙中的H+、Na+、K+、Cl－、興奮性氨基酸濃度繼續(xù)升高到一定水平時，這時膠質(zhì)細胞將對此作出另一方向的調(diào)節(jié)以緩沖正在急劇惡化的細胞外液環(huán)境，這時的膠質(zhì)細胞在增加清除K+的同時，將通過提高包括AQP4在內(nèi)的多種AQPs表達水平和活性［12］，以增加遭受破壞的血腦屏障對水分子的通透，增加細胞外間隙水含量，從而降低細胞外液中有害物質(zhì)的濃度，達到進一步保護神經(jīng)元功能的目的。已有證據(jù)［13］提示腦組織中AQP4可能調(diào)節(jié)腦脊液的形成及細胞外液的容積的變化。本實驗結(jié)果進一步證實AQP4與腦缺血性腦水腫的形成有關(guān)。與近年來國內(nèi)外的動物實驗及臨床觀察的研究結(jié)果一致［14～15］。

本課題是針灸專家于致順教授頭穴叢刺系統(tǒng)研究的總結(jié)與深化，其可能的作用機制是:在頭部相應(yīng)治療區(qū)進行“叢式”針刺，間斷行針，針刺每一穴位后，在所針刺穴位處產(chǎn)生了一定的生物磁場，多個場相互作用并增強場的效應(yīng)，通過傳導(dǎo)系統(tǒng)(經(jīng)絡(luò)、神經(jīng))作用于人體相應(yīng)的部位，增強對身體相應(yīng)部位的作用。這種生物磁場還可以直接的穿透高阻抗的顱骨作用于大腦皮層，改善腦血流，促進水液循環(huán)及物質(zhì)代謝，從而利于水腫的消除，并能產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)沖動，改善神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，促進神經(jīng)恢復(fù)。這樣的針刺方法從針刺部位上來說，使對頭部的刺激由原來點狀刺激或線狀刺激擴展到了面狀刺激，增加了針刺的刺激面積［16～17］，同時也增加了刺激量，從而體現(xiàn)出頭穴叢刺法相比于其它頭針療法的治療優(yōu)勢。

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The Effect of Cluster Acupuncture on Scalp Points on AQP4Expression in Cerebral Ischemica Reperfusion Rats

LIU Ting－ting1，ZHU Wen－zeng2△，JIN Hong3，HUANG Ri－long4
(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.Guang＇anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China; 3.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 4.Anhui Provincial Hospital of Chinese Medicine，Hefei 230031，China)

Objective:To explore cerebral protection mechanism of cluster acupuncture on scalp points (CASP)in cerebral ischemia reperfusion(CIR)rats.Methods:Focal cerebral ischemia was induced by intraluminal middle cerebral artery occlusion(MCAO)method using a monofilament thread in rats.Male Wistar rats were divided randomly into three groups:sham group、model group、and CASP group;each group was separated into 6 h，l d，2 d，3 d，5 d after reperfusion as subgroup for investigation.The expression of AQP4protein in CIR rats were measured by immunohistochemical method and the influence of the expression by CASP was observed.Results:Immunohistochemistry results indicated that compared with model group，the expression of AQP4has been significantly increased in CASP group(P＜0.05，P＜0.01).Conclusion:CASP method can regulate AQP4expression to reduce BBB permeability to prevent cerebral edema，through reducing cerebral edema，CASP method can save and protect damaged neurons，improve nervous function at early stage of CIR.

Cerebral ischemia reperfusion;Cluster acupuncture on scalp points(CASP);Cerebral edema; AQP4

R246.1

A

1005－0779(2012)008－0055－03

2012－01－15

黑龍江省自然科學(xué)基金項目，編號:2006D－61。

劉婷婷(1979－)，女，講師，主要研究方向:針刺治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

△通訊作者:朱文增(1971－)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向:頭針防治中風(fēng)和中醫(yī)臨床評價。