白小武，嵇 武，丁博文，張 強(qiáng)，李秋榮，李 寧

(本文編輯:潘雪飛; 英文編輯:王建東)

腸缺血再灌注(IR)是臨床多種疾病的病理生理過程，進(jìn)一步發(fā)展可以導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)等的發(fā)生。研究表明大黃素對腸缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，故本實(shí)驗(yàn)采用大鼠腸缺血再灌注模型，觀察大黃素對腸缺血再灌注腸黏膜細(xì)胞凋亡及緊密連接破壞的影響，探討大黃素保護(hù)腸黏膜屏障的機(jī)制，為臨床治療腸缺血再灌注提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性健康清潔級SD大鼠48只，8～9周齡，體重200～250 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SYXK(軍)2007-029;飼養(yǎng)室溫度22～23℃，環(huán)境濕度50%，喂以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飲食。

1.2 藥物與試劑 大黃素購于中國藥品生物制品檢定所;兔抗大鼠Claudin-1抗體和Occludin抗體購于Santa Cruz公司;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記法(TUNEL)染色試劑盒、山羊抗兔IgG-HRP二抗、牛血清白蛋白(BSA)購于南京碧波生物科技有限公司;β-actin抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度試劑盒購于南京建成生物工程研究所;全蛋白酶抑制劑混合片購于羅氏公司;Western Blot上樣緩沖液購于Fermentas公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.4 動物分組及模型制作 48只SD大鼠正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)(S)組、模型(IR)組、模型+生理鹽水(IRS)組和模型+大黃素(IRE)組，每組12只。大黃素用生理鹽水配制成10 g/L的混懸液備用。IRE組按40mg/(kg·d)劑量給予大黃素灌胃，IRS組給予等量的生理鹽水灌胃，兩組均為1次/d，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)第7天給藥2 h后，采用腸系膜上動脈(SMA)夾閉/松夾方法制備腸缺血再灌注模型［1］。假手術(shù)組只分離SMA，不夾閉;缺血30 min，再灌注2 h后麻醉大鼠、開腹取距回盲部5 cm處回腸標(biāo)本。

1.5 病理組織學(xué)觀察 取2 cm回腸標(biāo)本置于10%的中性甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化，按照Chiu’s損傷分級評分［2］。

1.6 透射電鏡觀察 將回腸標(biāo)本修成1 mm×1 mm×5 mm大小，2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，脫水、浸透、包埋、超薄切片，透射電子顯微鏡觀察腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接的改變。

1.7 腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測 取1cm回腸標(biāo)本迅速凍于液氮中，冰凍切片，按照TUNEL試劑盒說明書染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。400倍視野內(nèi)每組隨機(jī)選取100個相鄰視野，計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.8 Western Blot半定量測定 Claudin-1、Occludin蛋白含量 取3 cm回腸標(biāo)本，縱向剪開腸腔，用載玻片輕輕刮取并收集腸黏膜，置于－20℃保存。將保存組織放入組織勻漿器內(nèi)，每100 mg加1 ml全蛋白提取液(0.15 mol/L氯化鈉+0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷+1.0%聚氧乙烯辛基苯基醚，每10 ml+全蛋白酶抑制劑混合片1片)研磨。12000r/min(離心半徑6 cm)，4℃離心20 min，取上清液，測定總蛋白含量。分別取40μg的總蛋白加入上樣緩沖液，煮沸10 min后，先行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5 g/L BSA室溫封閉1 h，加入 Claudin-1、Occludin 和 β-actin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜，漂洗后加入IgG-HRP二抗(1∶3000)，室溫孵育1 h，漂洗、曝光成像。QuantityOne軟件分析測定結(jié)果，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對含量=目標(biāo)蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法(Claudin-1、Occludin的含量)，方差不齊時用Dunnett T3法(Chiu’s評分、凋亡指數(shù))，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對腸黏膜組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 S組腸道黏膜形態(tài)完整，絨毛結(jié)構(gòu)清晰，有部分絨毛尖端上皮下間隙略增寬，緊密連接和橋粒結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)完整，可見大量微絨毛，排列整齊。IR組腸道黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛破損，上皮細(xì)胞大量脫落，固有層暴露、出血，炎癥細(xì)胞在內(nèi)皮下聚集，微絨毛大量脫落、斷裂，緊密連接結(jié)構(gòu)模糊、腫脹，致密物質(zhì)減少。IRS組病理表現(xiàn)、電鏡表現(xiàn)與IR組相似。IRE組與IR組和IRS組比較，腸黏膜損傷程度較輕，上皮下間隙擴(kuò)張，部分絨毛頂端破損、脫落，毛細(xì)血管充血，電鏡下破壞明顯減輕，微絨毛增多，緊密連接結(jié)構(gòu)大致可見，腫脹緩解(圖1、圖2)。統(tǒng)計(jì)分析，與S組相比，IR組、IRS組、IRE組病理損傷明顯嚴(yán)重(P＜0.05);IR組與IRS組比較無明顯差別(P＞0.05);而IRE組與IR組、IRS組相比病理損傷明顯減輕(P＜0.05)。見表1。

2.2 大黃素對腸黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響 S組上皮及隱窩處可見少量凋亡細(xì)胞。IR組可見彌散性分布的凋亡細(xì)胞，數(shù)量明顯增加。IRS組與IR組結(jié)果相似。IRE組與IR組相比凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3)。統(tǒng)計(jì)分析，與S組相比，IR組、IRS組、IRE組凋亡細(xì)胞數(shù)量增多(P＜0.05);IR組與IRS組相比無明顯差別(P＞0.05);而IRE組與IR組、IRS組相比凋亡細(xì)胞數(shù)量減少(P＜0.05)。見表1。

2.3 大黃素對腸黏膜緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin含量的影響 S組正常表達(dá)Claudin-1、Occludin蛋白;IR組和IRS組Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，兩者之間無明顯差異(P＞0.05);IRE組 Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)明顯高于IR組和IRS組(P＜0.05)。見表1。

圖1 四組大鼠回腸病理改變(HE×200)

圖2 四組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)電鏡變化(×50000)

圖3 四組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(二氨基聯(lián)苯胺染色 ×400)

表1 四組大鼠腸黏膜屏障損傷指標(biāo)比較(±s)

表1 四組大鼠腸黏膜屏障損傷指標(biāo)比較(±s)

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 IR組比較，#P ＜0.05;與 IRS組比較，ΔP ＜0.05

組別 n Chiu’s病理評分 凋亡指數(shù)(%) Claudin-1(相對含量) Occludin(相對含量)S 組 12 0.44 ±0.66#Δ 1.04 ±0.96#Δ 7.22 ±0.85#Δ 2.24 ±0.53#Δ IR 組 12 3.40 ±0.97* 10.77 ±2.22* 3.68 ±0.85* 1.26 ±0.46*IRS 組 12 3.36 ±1.02* 10.69 ±2.22* 3.46 ±0.78* 1.13 ±0.38*IRE 組 12 2.47 ±0.98*#Δ 6.54 ±1.94*#Δ 7.34 ±1.28#Δ 2.29 ±0.48#Δ

3 討論

腸缺血再灌注損傷是休克、創(chuàng)傷、感染等多種臨床常見疾病重要的病理生理環(huán)節(jié)，可以引起腸黏膜屏障受損，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素移位，誘發(fā)SIRS、MODS和腸源性感染。腸缺血再灌注導(dǎo)致腸黏膜屏障受損的機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，目前還未完全闡明，主要包括組織氧代謝障礙、氧自由基損傷、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的作用、白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用等。西醫(yī)預(yù)防和治療腸黏膜屏障受損的措施一直存在不足之處，相關(guān)研究也未取得突破性進(jìn)展［3］。近年來，人們逐漸把治療研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了中醫(yī)藥方面，并取得了一些成就［4］。現(xiàn)代研究證實(shí)大黃素具有改善腸道血液循環(huán)、促進(jìn)腸道蠕動、刺激腸道分泌和殺滅微生物、降低腸道黏膜通透性、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用。在急性重癥胰腺炎中，大黃素可以顯著降低血清淀粉酶、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6的水平，減輕胰腺組織病理損傷，抑制NF-κB(核因子)活化，誘導(dǎo)細(xì)胞因子TGF-β1(人轉(zhuǎn)移生長因子β1)基因的表達(dá)，促進(jìn)多種細(xì)胞外基質(zhì)成分合成，增加胰腺組織DNA合成和蛋白含量，參與胰腺組織的再生和修復(fù)。亦有研究證實(shí)大黃素對重癥胰腺炎所致腸黏膜屏障損傷也具有保護(hù)作用，通過抑制小腸潘氏細(xì)胞分泌的隱凹素-4mRNA的下調(diào)［5］，并下調(diào)Bax(促凋亡因子)基因的表達(dá)抑制腸黏膜細(xì)胞過度凋亡，從而減輕腸黏膜屏障的損害，降低腸道內(nèi)毒素的易位［6］。大黃素可以通過增加大鼠肝移植后Bcl-2(B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白)蛋白表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的凋亡，從而減輕急性排斥反應(yīng)程度［7］。大黃素預(yù)處理在肝臟缺血再灌注時可以降低丙二醛的含量，減輕了脂質(zhì)過氧化損害程度［8］。本實(shí)驗(yàn)觀察了大黃素對腸缺血再灌注腸黏膜病理組織學(xué)的影響，大黃素預(yù)處理組腸黏膜病理損傷明顯減輕，Chiu’s評分降低，從而從病理學(xué)的角度明確了大黃素對腸缺血再灌注腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。

腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障［9-10］及化學(xué)屏障構(gòu)成，其中機(jī)械屏障是腸黏膜屏障的根本。機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腸黏膜上皮細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞之間完整的連接。其中腸黏膜上皮細(xì)胞死亡的主要方式是細(xì)胞凋亡，約占死亡細(xì)胞總數(shù)的80%。在腸缺血再灌注的過程中，細(xì)胞凋亡起了非常重要的作用。腸黏膜細(xì)胞凋亡的增加與腸缺血再灌注損傷密切相關(guān)［11］。大量的凋亡導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙，上皮細(xì)胞通透性增加，腸內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位［12］。本研究結(jié)果顯示大黃素預(yù)處理可以減少腸缺血再灌注造成的腸黏膜細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接方式有多種，包括緊密連接、粘附連接和縫隙連接，最主要的方式是緊密連接。緊密連接的破壞可以導(dǎo)致水和物質(zhì)跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的紊亂，是腸黏膜屏障受損的重要環(huán)節(jié)。緊密連接破壞的最重要的標(biāo)志是緊密連接蛋白的減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素預(yù)處理組腸缺血再灌注腸黏膜上皮之間緊密連接的破壞明顯減輕，微絨毛增多，緊密連接蛋白的含量增多。

上述研究證實(shí)大黃素可以保護(hù)腸黏膜細(xì)胞減少凋亡，保護(hù)緊密連接結(jié)構(gòu)減少破壞，維護(hù)腸黏膜屏障的完整性，降低腸黏膜通透性，進(jìn)一步證實(shí)了大黃素對腸道缺血再灌注所致腸黏膜屏障損傷具有保護(hù)作用，為大黃素在腸黏膜屏障損傷中的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。

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