李 爽 劉玉蘭 石海峰 陳 逢 朱惠玲 侯永清丁斌鷹 皮定安 冷煒博

(武漢工業(yè)學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，武漢 430023)

免疫應(yīng)激雖然能夠激活免疫系統(tǒng)以抵抗外來病原對機體的損傷，但免疫系統(tǒng)的過度激活會消耗大量能量和營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致動物生長性能下降，對畜牧業(yè)造成一定的損失[1]。因此，抑制或緩解免疫應(yīng)激對畜牧業(yè)有重要意義。傳統(tǒng)營養(yǎng)學(xué)認為，天冬酰胺(ASN)是一種非必需氨基酸，因而忽略了其在動物營養(yǎng)上的作用。但是有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASN不但可以刺激腸黏膜細胞增殖[2]，而且還可以增加有氧條件下的新陳代謝，增加產(chǎn)能，在運動條件下緩解疲勞[3]，并且在機體免疫功能方面扮演重要角色[4]。此外，Wu 等[5]認為 ASN 是一種精氨酸(Arg)家族氨基酸，其在體內(nèi)可以通過脫氨基和轉(zhuǎn)氨基作用等一系列途徑生成Arg和谷氨酰胺(Gln)，而Arg和Gln能在調(diào)節(jié)腸道功能、免疫和炎癥方面發(fā)揮重要的作用[5]。因此，我們預(yù)測ASN可能也具有重要的生理功能。目前在畜禽研究領(lǐng)域鮮有ASN的研究報道。本試驗通過給仔豬注射大腸桿菌脂多糖(LPS)建立免疫應(yīng)激模型，以研究ASN對免疫應(yīng)激仔豬生長性能、血細胞分類計數(shù)和血液生化指標的影響，旨在為ASN是否參與仔豬免疫應(yīng)激的調(diào)控提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ASN:有效成分＞99.4%，由武漢阿米諾科技有限公司提供。

LPS:大腸桿菌血清型055∶B5，美國 Sigma公司提供，注射時溶解于生理鹽水。注射液的LPS含量為500 μg/mL，按照0.2 mL/kg BW 注射，即100 μg/kg BW。

1.2 飼糧組成

基礎(chǔ)飼糧配制參照NRC(1998)豬的營養(yǎng)需要，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗動物與設(shè)計

選擇(21±1)日齡斷奶的“杜×長×大”斷奶仔豬24頭，采用單因子試驗設(shè)計，分為4個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。4個組分別為:對照組(基礎(chǔ)飼糧);LPS組(基礎(chǔ)飼糧+LPS);0.5%ASN組(基礎(chǔ)飼糧+LPS+0.5%ASN);1.0%ASN組(基礎(chǔ)飼糧+LPS+1.0%ASN)。飼糧用丙氨酸進行等氮處理。試驗第16天，分別給LPS組、0.5%ASN組和1.0%ASN組的豬注射100 μg/kg BW的 LPS(0.2 mL)，對照組注射等量的生理鹽水。本試驗采用單次注射LPS建立急性免疫應(yīng)激模型，LPS的注射次數(shù)和劑量參考Liu等[6]和 Wright等[7]。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室進行。舍溫保持在25～27℃。豬欄面積1.20 m×1.10 m。粉料飼喂，自由采食和飲水。按常規(guī)程序定期驅(qū)蟲和免疫。

1.5 樣品的采集

試驗第16天，分別于注射LPS或生理鹽水后4和24 h，從仔豬前腔靜脈用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空管采血2 mL進行血細胞分類計數(shù)。同時，用促凝真空管采血10 mL，靜置15 min，3 000 r/min離心10 min得到血清，分裝后-80℃保存，待測血液生化指標。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 生長性能

分別在試驗第1天、第16天和第24天清晨將仔豬空腹個體稱重和結(jié)算飼料消耗，計算試驗豬的平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.6.2 血細胞分類計數(shù)

血細胞含量及其分類計數(shù)采用日本Sysmex K-4500血液自動分析儀測定。

1.6.3 血液生化指標

采用日立-7100全自動生化分析儀測定下列血液生化指標:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic trans-aminase，GPT，酶法)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，GOT，酶法)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT，硝基苯酚速率法)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP，連續(xù)監(jiān)測法)活性和肌酐(creatinine，CREA，酶法)、葡萄糖(glucose，GLU，GOD-PAP 法)、尿素氮(urea nitrogen，UN，酶偶聯(lián)速率法)、總蛋白(total protein，TP，雙縮脲法)、白蛋白(albumin，ALB，BCG 比色法)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶(GPT/GOT)值。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標準，以P＜0.10為差異顯著性趨勢。

2 結(jié)果

2.1 ASN對LPS刺激斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，第1～15天(應(yīng)激前)，LPS組斷奶仔豬的生長性能與其他各組無顯著差異(P＞0.05)。第16～24天(應(yīng)激后)，LPS組顯著降低了仔豬的平均日采食量和平均日增重(P＜0.05)，而0.5%ASN組顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的仔豬平均日增重的下降(P＜0.05)。第1～24天(全期)，LPS組斷奶仔豬的生長性能與其他各組無顯著差異(P＞0.05)。

表2 ASN對LPS刺激斷奶仔豬生長性能的影響Table2 Effects of ASN on growth performance of weaner pigs challenged with LPS

2.2 ASN對LPS刺激斷奶仔豬血細胞分類計數(shù)的影響

由表3可知，白細胞方面，在4 h時，LPS刺激導(dǎo)致白細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞數(shù)量顯著下降(P＜0.05)，嗜酸性粒細胞比例顯著上升(P＜0.05)，嗜酸性粒細胞數(shù)量和單核細胞比例有下降趨勢(P＜0.10)。0.5%ASN組顯著提高了淋巴細胞和單核細胞比例(P＜0.05)。1.0%ASN組顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的嗜酸性粒細胞比例的上升(P＜0.05)，對單核細胞比例的降低也有緩解趨勢(P＜0.10)。在24 h時，LPS刺激導(dǎo)致白細胞數(shù)量、嗜中性粒細胞數(shù)量及嗜中性粒細胞比例顯著上升(P＜0.05)，淋巴細胞數(shù)量、淋巴細胞比例、單核細胞比例顯著下降(P＜0.05)。1.0%ASN組顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的白細胞和嗜中性粒細胞數(shù)量的上升(P＜0.05)及淋巴細胞數(shù)量、淋巴細胞比例的下降(P＜0.05)，對嗜中性粒細胞比例的上升也有緩解的趨勢(P＜0.10)。

紅細胞和血小板方面，在4 h時，LPS刺激導(dǎo)致血紅蛋白含量、紅細胞平均血紅蛋白和紅細胞平均血紅蛋白濃度顯著上升(P＜0.05)，血小板數(shù)量顯著下降(P＜0.05)。1.0%ASN組顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的血小板數(shù)量的降低(P＜0.05)。在24 h時，LPS刺激導(dǎo)致紅細胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細胞壓積和血小板數(shù)量顯著下降(P＜0.05)。0.5%ASN組顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的紅細胞數(shù)量和紅細胞壓積的降低(P＜0.05)。1.0%ASN組顯著緩解了血紅蛋白含量和紅細胞壓積的下降(P＜0.05)。

2.3 ASN對LPS刺激斷奶仔豬血液生化指標的影響

量顯著上升(P＜0.05)。在24 h時，LPS刺激導(dǎo)致谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、尿素氮含量顯著升高(P＜0.05)，葡萄糖含量以及GPT/GOT值顯著下降(P＜0.05)。0.5%ASN和1.0%ASN組顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的上升(P＜0.05)，0.5%ASN組顯著提高了葡萄糖含量(P＜0.05)，對GPT/GOT值的降低也有緩解的趨勢(P＜0.10)。1.0%ASN組顯著緩解了LPS刺激導(dǎo)致的GPT/GOT值降低(P＜0.05)，對尿素氮含量的上升有緩解的趨勢(P＜0.10)，并顯著提高了總蛋白含量(P＜0.05)，降低了堿性磷酸酶活性(P＜0.05)。

由表4可知，在4 h時，LPS刺激導(dǎo)致肌酐含

表3 ASN對LPS刺激斷奶仔豬的血細胞分類計數(shù)的影響Table3 Effects of ASN on blood cell differential count of weaner pigs challenged with LPS

續(xù)表3

續(xù)表3

表4 ASN對LPS刺激斷奶仔豬的血液生化指標的影響Table4 Effects of ASN on blood biochemical indices of weaner pigs challenged with LPS

3 討論

本試驗在第1～15天，ASN對仔豬的生長性能未產(chǎn)生顯著影響，這可能與基礎(chǔ)飼糧中ASN足以滿足仔豬正常生理狀態(tài)下的需求有關(guān)。而在應(yīng)激、疾病和感染的情況下，ASN可能通過轉(zhuǎn)化為天冬氨酸(Asp)來合成 Arg[5]，而 Arg又能促進多種內(nèi)分泌激素(如生長激素、胰島素、胰高血糖素)的釋放[8]，促進蛋白質(zhì)的合成和抑制蛋白質(zhì)的分解[9]，從而間接促進動物生長。本試驗結(jié)果也顯示，在第16～24天，添加0.5%ASN可緩解 LPS刺激導(dǎo)致的平均日增重下降。這表明在應(yīng)激情況下，需在基礎(chǔ)飼糧中額外添加ASN以滿足機體需要。然而Wu等[10]報道，Arg添加量過高會對腸道產(chǎn)生負面影響，本試驗結(jié)果表明，添加1.0%ASN的平均日增重比添加0.5%ASN的平均日增重低，這可能是由于高水平的ASN使斷奶仔豬產(chǎn)生過多的內(nèi)源性Arg，從而對其腸道產(chǎn)生負面影響，進而影響其消化吸收功能并降低其平均日增重。這表明，飼糧中ASN的添加量不宜過高。

白細胞俗稱白血球，通常稱為免疫細胞，在體內(nèi)擔負許多重要功能，它具有吞噬異物并產(chǎn)生抗體的作用，機體傷病的損傷治愈能力，抗御病原體入侵的能力，對疾病的免疫抵抗力等。當機體發(fā)生炎癥或其他疾病時，白細胞數(shù)量及其比例都會發(fā)生變化[11]。本試驗中，ASN能顯著緩解因LPS導(dǎo)致的白細胞和嗜中性粒細胞數(shù)量的上升，顯著提高淋巴細胞數(shù)量和淋巴細胞比例。Duval等[12]在鼠腫瘤細胞上也得出相似的結(jié)論。研究表明，ASN可能在體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化為Asp，作為合成嘌呤和嘧啶核苷酸的底物，Asp對免疫細胞增殖很重要[13]，ASN還能通過轉(zhuǎn)化為Asp參與體內(nèi)的精氨酸-一氧化氮(Arg-NO)循環(huán)，在免疫應(yīng)激的條件下大量生成一氧化氮(NO)[13]，NO能誘發(fā)一些保護性因子的產(chǎn)生，同時增強巨噬細胞的活性，增加對內(nèi)毒素的清除，抑制白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附和浸潤，從而減輕炎癥反應(yīng)[14]。

紅細胞是脊椎動物體內(nèi)通過血液運送氧氣的最主要的媒介，同時還能在免疫方面特別是天然免疫和一些特異性免疫方面發(fā)揮重要作用。血紅蛋白是高等生物體內(nèi)負責(zé)運載氧的一種蛋白質(zhì)。血小板的主要功能是凝血和止血，修補破損的血管。本試驗結(jié)果表明，添加0.5%ASN能顯著緩解因LPS刺激導(dǎo)致的紅細胞數(shù)量的下降，添加1.0%ASN能使受LPS刺激而降低的血紅蛋白數(shù)量顯著上升，并能顯著緩解因LPS刺激導(dǎo)致的血小板數(shù)量的降低，因此，ASN可增強機體的凝血功能并促進紅細胞和血紅蛋白的生成，從而增加細胞的氧化供能來滿足機體的需要。與本試驗研究結(jié)果類似，Marquezi等[3]在鼠上的研究結(jié)果表明，ASN能提高體內(nèi)的新陳代謝能力以增加能量供給，并在劇烈運動下具有緩解機體疲勞的功能。

白蛋白由肝臟合成，是機體蛋白質(zhì)來源之一，可用于組織修補和能量供給。血清球蛋白則是源于B細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)化為漿細胞后分泌形成球蛋白，能反映機體的抵抗力。血清總蛋白則是前兩者之和。這3個指標降低通常是動物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的標志之一[15]。尿素氮是機體蛋白質(zhì)代謝的主要終產(chǎn)物，其含量主要反映機體的代謝能力。葡萄糖是血液中的糖分，葡萄糖必須保持一定的水平，機體的新陳代謝才能正常進行。本試驗結(jié)果表明，ASN能顯著提高血液葡萄糖和總蛋白含量，對血液尿素氮含量的上升也有緩解趨勢。ASN可能在體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化為Asp從而在機體內(nèi)進入肝臟和腎臟參與無氧代謝，經(jīng)糖異生作用生成葡萄糖或糖原，提高機體內(nèi)葡萄糖含量，避免了機體蛋白質(zhì)降解為生糖氨基酸或其他糖異生的前體物質(zhì)，從而減少了機體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解，因此降低了血液尿素氮含量。

血液谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶等活性的升高通常是應(yīng)激反應(yīng)的一個標志[16]，同時這3個指標也是反映肝臟功能的重要指標，其活性升高表示肝臟受到損傷。本試驗結(jié)果顯示，ASN能顯著緩解因LPS刺激所導(dǎo)致的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的升高和GPT/GOT值的降低，并能顯著降低堿性磷酸酶活性。這可能是ASN在體內(nèi)通過一系列脫氨基和轉(zhuǎn)氨基作用能轉(zhuǎn)化為Gln[5]，而Gln能增加肝臟中蛋白質(zhì)、DNA和RNA的合成[17-18]，并能生成谷胱甘肽來減輕因LPS刺激而產(chǎn)生的氧自由基對肝臟的損傷，從而起到對肝臟的保護作用。

4 結(jié)論

①飼糧中添加ASN可緩解LPS導(dǎo)致的仔豬應(yīng)激，改善仔豬生長性能及機體有關(guān)生化免疫指標。

②飼糧中ASN的添加量應(yīng)適當，本試驗條件下以0.5%較適宜，1.0%可產(chǎn)生負面影響。

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