韓 杰 邊連全 劉顯軍 張 飛 楊侃侃

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866;2.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系，洛陽 471022;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研種豬場，沈陽 110866)

免疫應(yīng)激能夠使畜禽在行為和代謝上發(fā)生改變，如出現(xiàn)厭食、嗜睡，將用于生長的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)向用于維持免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致畜禽生長抑制[1-2]。免疫應(yīng)激的發(fā)生與免疫系統(tǒng)被非正常激活有關(guān)[3-4]。對3～4周齡的仔豬實(shí)施斷奶，由于母源抗體供應(yīng)中斷，且仔豬自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，易發(fā)生免疫應(yīng)激，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)生長停滯、飼料效率降低、腹瀉等現(xiàn)象[5]。因此，在畜禽飼糧中添加免疫調(diào)節(jié)劑是減緩免疫應(yīng)激的重要措施之一。刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide，ASPS)是從刺五加根莖中分離出的免疫活性多糖，在體內(nèi)外均可調(diào)節(jié)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能[6-8]，但將ASPS應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中的研究鮮見報道。本課題組前期研究已經(jīng)表明，ASPS應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧中可緩解斷奶仔豬應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)仔豬的免疫功能，促進(jìn)仔豬生長[9]。本試驗(yàn)旨在以早期斷奶仔豬為對象，繼續(xù)深入探討ASPS對斷奶仔豬血液免疫指標(biāo)的影響，為ASPS作為免疫調(diào)控劑在仔豬飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取96頭體重相近的(28±3)日齡“長白×約克夏”二元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分為6組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)4頭豬，試驗(yàn)期21 d。對照組飼喂不添加抗生素的基礎(chǔ)飼糧，其為參照NRC(1998)仔豬營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加150、300、500、800 和1 000 mg/kg ASPS的試驗(yàn)飼糧。仔豬采用地面飼養(yǎng)，半開放豬舍，自由采食和飲水，免疫和驅(qū)蟲程序按豬場常規(guī)同步進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)儀器包括LRHS-150B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京萊凱博儀器設(shè)備有限公司)、BioTek Synergy-2多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)、Uritest-3000型全自動血細(xì)胞分析儀(優(yōu)利特集團(tuán)有限公司)、過濾除菌裝置和濾膜。

1.2.2 ASPS的提取和分析

采用熱水浸提乙醇沉淀的方法提取ASPS。將干燥至恒重的刺五加根粉碎，過40目篩，在熱水中煮4次，每次2 h，合并濾液，將濾液真空濃縮至1∶1，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)，將上述濾液與等體積的氯仿-正丁醇混合液(體積比為5∶1)振蕩，過濾，取濾液加入4倍體積的無水乙醇，放置過夜，次日3 000×g離心20 min，取沉淀進(jìn)行低溫蒸干后，加蒸餾水溶解，再加3倍體積的無水乙醇攪拌，干燥后所得的棕黃色粉末即為ASPS。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量為82.5%。

1.3 試驗(yàn)樣品制備

試驗(yàn)第21天，從每個重復(fù)隨機(jī)取1頭仔豬，共24頭，用真空采血管從每頭仔豬的前腔靜脈采集血液2份，1份用普通真空采血管采血5 mL，3 500 r/min離心5 min，分離血清，-20℃冰箱凍存，用于測定血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白 細(xì) 胞 介 素 -4(interleukin-4，IL-4)、干擾素 - γ(interferon-γ，IFN-γ)含量以及免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)抗體水平;1份用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采血1 mL，用于血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 檢測指標(biāo)及測定方法

1.4.1 血清細(xì)胞因子含量和抗體水平測定

血清細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IFN-γ含量和 IgG、IgA、IgM抗體水平均采用豬的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA Kit，R ＆ D System，美國)測定，并嚴(yán)格按照說明書提供的方法和步驟操作。

1.4.2 外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的測定

外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)采用全自動血細(xì)胞分析儀(Uritest-3000)測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理，然后經(jīng)SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型(GLM)進(jìn)行方差分析和二次曲線回歸分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 ASPS對斷奶仔豬外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響

由表2可知，飼糧中添加ASPS對仔豬外周血紅細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量無顯著影響(P＞0.05)，但能顯著增加外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)，其中500 mg/kg ASPS組和800 mg/kg ASPS組仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量均極顯著高于對照組(P＜0.01)，1 000 mg/kg ASPS組仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組(P＜0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析可知，外周血紅細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)、白細(xì)胞數(shù)量(P＜0.01)和淋巴細(xì)胞數(shù)量(P＜0.01)隨ASPS添加水平增加呈二次曲線變化。

2.2 ASPS對斷奶仔豬血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ含量的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加ASPS能顯著提高仔豬血清細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量(P＜0.05);對血清細(xì)胞因子IL-4含量無顯著影響(P＞0.05)。其中，添加 500、800和1 000 mg/kg ASPS極顯著提高了血清細(xì)胞因子IFN-γ含量(P ＜0.01)，800 mg/kg ASPS顯著提高了血清細(xì)胞因子IL-2含量(P＜0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析可知，隨ASPS添加水平增加，IL-2(P＜0.05)和IFN-γ含量(P＜0.01)呈二次曲線變化。

表2 ASPS對斷奶仔豬外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響Table2 Effects of dietary ASPS on peripheral blood cell differential counts of weaner piglets

表3 ASPS對斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響Table3 Effects of dietary ASPS on serum cytokine contents of weaner piglets pg/mL

2.3 刺五加多糖對斷奶仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平的影響

由表4可知，飼糧中添加ASPS對仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平均無顯著影響(P＞0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析可知，隨ASPS添加水平增加，仔豬血清IgA抗體水平呈線性變化(P＜0.05)。

表4 ASPS對斷奶仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平的影響Table4 Effects of dietary ASPS on the antibody levels of IgG，IgA and IgM in serum of weaner piglets g/L

3 討論

一般說來，仔豬可從2種途徑獲得免疫保護(hù)，一是通過吮吸母乳獲得母源抗體而建立的被動免疫，二是自然狀態(tài)下仔豬自身免疫系統(tǒng)的逐漸發(fā)育完善而建立起的主動免疫。對3～4周齡的仔豬實(shí)施斷奶，即中斷仔豬的被動免疫保護(hù)，而仔豬自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，主動免疫功能直到仔豬4～5周齡時仍較弱。故仔豬斷奶后特別容易受到環(huán)境中的病原微生物的侵害而發(fā)生免疫應(yīng)激，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)生長停滯、飼料效率降低、腹瀉等現(xiàn)象[10-11]。

血細(xì)胞是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的主要成分，是抵御病原微生物等入侵機(jī)體的主要防線。其中，紅細(xì)胞是含量最多的血細(xì)胞，具有向機(jī)體運(yùn)送O2的重要功能，同時還具有免疫功能。本試驗(yàn)中，隨ASPS添加水平的增加，仔豬外周血紅細(xì)胞數(shù)量呈二次曲線變化，這在一定程度上說明ASPS對仔豬的血紅蛋白合成、造血功能和免疫功能的提高有促進(jìn)作用。白細(xì)胞總數(shù)及其分類計(jì)數(shù)的結(jié)果可以提示機(jī)體的易感性、侵入微生物的毒力、疾病的性質(zhì)等，中性粒細(xì)胞含量的高低可直接反映炎癥的發(fā)展情況，而淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞中參加機(jī)體免疫功能的最重要的成分，根據(jù)其表面抗原、受體及功能等不同，淋巴細(xì)胞可分為T細(xì)胞和B細(xì)胞，T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，B細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫。本試驗(yàn)結(jié)果提示，ASPS可顯著增加外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量，對提高仔豬免疫力有一定的作用。

細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。IL-2和IFN-γ可由Th1型T細(xì)胞分泌，主要促進(jìn)T細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)。IL-4主要由Th2型T細(xì)胞分泌，參與B細(xì)胞增殖以及體液免疫[12]。IL-2、IFN-γ 的大量分泌可以下調(diào)體液免疫應(yīng)答。而IL-4、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等細(xì)胞因子可下調(diào)細(xì)胞免疫應(yīng)答[13-14]。以往關(guān)于ASPS影響細(xì)胞因子分泌的研究表明，ASPS對S801白血病細(xì)胞系具有促誘生IFN-γ的效應(yīng)[15];能明顯增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性，并能促進(jìn)刀豆球蛋白(ConA)刺激的小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2[16];10 mg/L ASPS對人淋巴細(xì)胞在ConA刺激下所產(chǎn)生的IFN-α或IFN-γ的效價均比常規(guī)誘生組高5～7倍，是理想的干擾素促誘生劑[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ASPS可顯著促進(jìn)IL-2、IFN-γ分泌，而對血清IL-4含量影響不顯著，這與上述以往的研究結(jié)果一致。另外，從本試驗(yàn)結(jié)果還可看出，ASPS提高仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)IL-2和IFN-γ分泌存在劑量依賴關(guān)系，當(dāng)劑量為500～1 000 mg/kg時，能顯著或極顯著提高仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)IFN-γ分泌，800 mg/kg的ASPS能顯著促進(jìn)IL-2分泌，而當(dāng)劑量低于500 mg/kg時，這種影響作用并不顯著。上述結(jié)果提示ASPS可能是通過促進(jìn)IL-2和IFN-γ的分泌而提高機(jī)體的免疫功能的。

在ASPS影響機(jī)體的體液免疫方面，以往有以小鼠為對象的研究報道，指出ASPS可顯著增強(qiáng)小鼠脾分泌IgM的脾臟抗體形成細(xì)胞(plaque forming cell，PFC)，100 mg/kg ASPS 可顯著增強(qiáng)小鼠脾分泌IgG的PFC和小鼠對牛血清蛋白誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)性[18]。從刺五加組織培養(yǎng)的果實(shí)中分離獲得的果多糖可顯著增加分泌IgM的B細(xì)胞數(shù)量[7]。這些基礎(chǔ)研究均指明了ASPS對小鼠體液免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用。而本試驗(yàn)指出ASPS對IL-4分泌及血清IgA、IgM、IgG抗體水平(血清免疫球蛋白含量或效價高低是反映機(jī)體體液免疫水平的重要指標(biāo)，其含量或效價越高表示機(jī)體的體液免疫水平越高)影響均不顯著，提示ASPS可能對仔豬體液免疫功能無顯著影響，這與上述的以往研究結(jié)果不一致，分析這種結(jié)果的差異可能是研究動物小鼠和仔豬的種屬差異所致。

4 結(jié)論

①ASPS能劑量依賴性地增加仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ分泌，對仔豬的免疫功能有改善作用。

②ASPS促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌可能是提高仔豬免疫功能的因素之一。

[1]KLASING K C，BARNES D M.Decreased amino acid requirements of growing chicks due to immunologic stress[J].The Journal of Nutrition，1988，118(9):1158-1164.

[2]COOK M E，MILLER C C，PARK Y，et al.Immune modulation by altered nutrient metabolism:nutritional control of immune-induced growth depression[J].Poultry Science，1993，72(7):1301-1305.

[3]JOHNSON R W.Inhibition of growth by pro-inflammatory cytokines:an integrated view[J].Journal of Animal Science，1997，75(5):1244-1255.

[4]WEBEL D M，F(xiàn)INCK B N，BAKER D H，et al.Time course of increased plasma cytokines，cortisol，and urea nitrogen in pigs following intraperitoneal injection of lipopolysaccharide[J].Journal of Animal Science，1997，75(6):1514-1520.

[5]BARNETT K L，KORNEGAY E T，RISLEY C R，et al.Characterization of creep feed consumption and its subsequent effects on immune response，scouring index and performance of weanling pigs[J].Journal of Animal Science，1989，67(10):2698-2708.

[6]STEINMANN G G，ESOERESTER A，JOLLER P.Immunopharmacological in vitro effects of Eleutherococcus senticosus extracts[J].Arzneimittel Forschung，2001，5l(1):76-83.

[7]HAN S B，YOON Y D，AHN H J，et al.Toll-like receptor-mediated activation of B cells and macropahges by polysaccharide isolated from cell culture of Acanthopanax senticosus[J].International Immunopharmacology，2003，3(9):1301-1312.

[8]佟麗，黃添友，吳波，等.三種植物多糖對脾細(xì)胞產(chǎn)生 IL-2的影響[J].中國藥理學(xué)通報，1994，10(6):473-474.

[9]韓杰，邊連全，劉顯軍，等.刺五加多糖對斷奶仔豬生長性能和免疫指標(biāo)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2012(11):2203-2209.

[10]HEDEMANN M S，JENSEN B.Variations in enzyme activity in stomach and pancreatic tissue and digesta in piglets around weaning[J].Archives of Animal Nutrition，2004，58(1):47-59.

[11]MCGLONE J，POND W G.Pig production:biological principles and applications[M].New York:Delmar Cengage Learning，2003:23.

[12]RAYMOND C R，WILKIE B N.Th-1/Th-2 type cy-tokine profiles of pig T-cells cultured with antigentreated monocyte-derived dendritic cells[J].Vaccine，2004，22(8):1016-1023.

[13]SZABO S J，KIM S T，COSTA G L，et al.A novel transcription factor，T-bet，directs Th1 lineage commitment[J].Cell，2000，100(6):655-669.

[14]FIORENTINO D F，ZLOTNIK A，MOSMANN T R，et al.IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages[J].Journal of Immunology，1991，147(11):3815-3822.

[15]楊吉成，劉靜山，徐培君，等.刺五加多糖對白血病細(xì)胞系促誘生干擾素動力學(xué)研[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986，6(4):231-233.

[16]謝蜀生，呂秀鳳，秦鳳華，等.刺五加多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)理初探[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1989，9(3):153-155.

[17]錢農(nóng)，楊吉成，盛偉華，等.人參多糖及其皂甙等5種中藥提取物促誘生人干擾素的研究[J].蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997，17(1):31-32.

[18]許士凱.刺五加多糖(ASPS)對小鼠免疫功能的影響[J].中成藥，1990，12(3):25-26.