韓 杰 邊連全 劉顯軍 張 飛 楊侃侃
(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,沈陽 110866;2.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系,洛陽 471022;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研種豬場,沈陽 110866)
免疫應(yīng)激能夠使畜禽在行為和代謝上發(fā)生改變,如出現(xiàn)厭食、嗜睡,將用于生長的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)向用于維持免疫反應(yīng),最終導(dǎo)致畜禽生長抑制[1-2]。免疫應(yīng)激的發(fā)生與免疫系統(tǒng)被非正常激活有關(guān)[3-4]。對3~4周齡的仔豬實(shí)施斷奶,由于母源抗體供應(yīng)中斷,且仔豬自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善,易發(fā)生免疫應(yīng)激,導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)生長停滯、飼料效率降低、腹瀉等現(xiàn)象[5]。因此,在畜禽飼糧中添加免疫調(diào)節(jié)劑是減緩免疫應(yīng)激的重要措施之一。刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide,ASPS)是從刺五加根莖中分離出的免疫活性多糖,在體內(nèi)外均可調(diào)節(jié)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能[6-8],但將ASPS應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中的研究鮮見報(bào)道。本課題組前期研究已經(jīng)表明,ASPS應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧中可緩解斷奶仔豬應(yīng)激反應(yīng),增強(qiáng)仔豬的免疫功能,促進(jìn)仔豬生長[9]。本試驗(yàn)旨在以早期斷奶仔豬為對象,繼續(xù)深入探討ASPS對斷奶仔豬血液免疫指標(biāo)的影響,為ASPS作為免疫調(diào)控劑在仔豬飼糧中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
選取96頭體重相近的(28±3)日齡“長白×約克夏”二元雜交斷奶仔豬,隨機(jī)分為6組,每組4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)4頭豬,試驗(yàn)期21 d。對照組飼喂不添加抗生素的基礎(chǔ)飼糧,其為參照NRC(1998)仔豬營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加150、300、500、800 和1 000 mg/kg ASPS的試驗(yàn)飼糧。仔豬采用地面飼養(yǎng),半開放豬舍,自由采食和飲水,免疫和驅(qū)蟲程序按豬場常規(guī)同步進(jìn)行。
1.2.1 試驗(yàn)儀器
試驗(yàn)儀器包括LRHS-150B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京萊凱博儀器設(shè)備有限公司)、BioTek Synergy-2多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)、Uritest-3000型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(優(yōu)利特集團(tuán)有限公司)、過濾除菌裝置和濾膜。
1.2.2 ASPS的提取和分析
采用熱水浸提乙醇沉淀的方法提取ASPS。將干燥至恒重的刺五加根粉碎,過40目篩,在熱水中煮4次,每次2 h,合并濾液,將濾液真空濃縮至1∶1,采用Sevag法除去蛋白質(zhì),將上述濾液與等體積的氯仿-正丁醇混合液(體積比為5∶1)振蕩,過濾,取濾液加入4倍體積的無水乙醇,放置過夜,次日3 000×g離心20 min,取沉淀進(jìn)行低溫蒸干后,加蒸餾水溶解,再加3倍體積的無水乙醇攪拌,干燥后所得的棕黃色粉末即為ASPS。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量為82.5%。
試驗(yàn)第21天,從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取1頭仔豬,共24頭,用真空采血管從每頭仔豬的前腔靜脈采集血液2份,1份用普通真空采血管采血5 mL,3 500 r/min離心5 min,分離血清,-20℃冰箱凍存,用于測定血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白 細(xì) 胞 介 素 -4(interleukin-4,IL-4)、干擾素 - γ(interferon-γ,IFN-γ)含量以及免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)抗體水平;1份用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采血1 mL,用于血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %
1.4.1 血清細(xì)胞因子含量和抗體水平測定
血清細(xì)胞因子 IL-2、IL-4、IFN-γ含量和 IgG、IgA、IgM抗體水平均采用豬的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA Kit,R & D System,美國)測定,并嚴(yán)格按照說明書提供的方法和步驟操作。
1.4.2 外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的測定
外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(Uritest-3000)測定。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理,然后經(jīng)SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型(GLM)進(jìn)行方差分析和二次曲線回歸分析,采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。
由表2可知,飼糧中添加ASPS對仔豬外周血紅細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量無顯著影響(P>0.05),但能顯著增加外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),其中500 mg/kg ASPS組和800 mg/kg ASPS組仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量均極顯著高于對照組(P<0.01),1 000 mg/kg ASPS組仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析可知,外周血紅細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)、白細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)和淋巴細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)隨ASPS添加水平增加呈二次曲線變化。
由表3可知,與對照組相比,飼糧中添加ASPS能顯著提高仔豬血清細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量(P<0.05);對血清細(xì)胞因子IL-4含量無顯著影響(P>0.05)。其中,添加 500、800和1 000 mg/kg ASPS極顯著提高了血清細(xì)胞因子IFN-γ含量(P <0.01),800 mg/kg ASPS顯著提高了血清細(xì)胞因子IL-2含量(P<0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析可知,隨ASPS添加水平增加,IL-2(P<0.05)和IFN-γ含量(P<0.01)呈二次曲線變化。
表2 ASPS對斷奶仔豬外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響Table2 Effects of dietary ASPS on peripheral blood cell differential counts of weaner piglets
表3 ASPS對斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響Table3 Effects of dietary ASPS on serum cytokine contents of weaner piglets pg/mL
由表4可知,飼糧中添加ASPS對仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平均無顯著影響(P>0.05)。對不同ASPS梯度的飼糧處理效應(yīng)進(jìn)行線性和二次曲線回歸分析可知,隨ASPS添加水平增加,仔豬血清IgA抗體水平呈線性變化(P<0.05)。
表4 ASPS對斷奶仔豬血清IgG、IgA、IgM抗體水平的影響Table4 Effects of dietary ASPS on the antibody levels of IgG,IgA and IgM in serum of weaner piglets g/L
一般說來,仔豬可從2種途徑獲得免疫保護(hù),一是通過吮吸母乳獲得母源抗體而建立的被動(dòng)免疫,二是自然狀態(tài)下仔豬自身免疫系統(tǒng)的逐漸發(fā)育完善而建立起的主動(dòng)免疫。對3~4周齡的仔豬實(shí)施斷奶,即中斷仔豬的被動(dòng)免疫保護(hù),而仔豬自身的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善,主動(dòng)免疫功能直到仔豬4~5周齡時(shí)仍較弱。故仔豬斷奶后特別容易受到環(huán)境中的病原微生物的侵害而發(fā)生免疫應(yīng)激,導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)生長停滯、飼料效率降低、腹瀉等現(xiàn)象[10-11]。
血細(xì)胞是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的主要成分,是抵御病原微生物等入侵機(jī)體的主要防線。其中,紅細(xì)胞是含量最多的血細(xì)胞,具有向機(jī)體運(yùn)送O2的重要功能,同時(shí)還具有免疫功能。本試驗(yàn)中,隨ASPS添加水平的增加,仔豬外周血紅細(xì)胞數(shù)量呈二次曲線變化,這在一定程度上說明ASPS對仔豬的血紅蛋白合成、造血功能和免疫功能的提高有促進(jìn)作用。白細(xì)胞總數(shù)及其分類計(jì)數(shù)的結(jié)果可以提示機(jī)體的易感性、侵入微生物的毒力、疾病的性質(zhì)等,中性粒細(xì)胞含量的高低可直接反映炎癥的發(fā)展情況,而淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞中參加機(jī)體免疫功能的最重要的成分,根據(jù)其表面抗原、受體及功能等不同,淋巴細(xì)胞可分為T細(xì)胞和B細(xì)胞,T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫,B細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫。本試驗(yàn)結(jié)果提示,ASPS可顯著增加外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量,對提高仔豬免疫力有一定的作用。
細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。IL-2和IFN-γ可由Th1型T細(xì)胞分泌,主要促進(jìn)T細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)。IL-4主要由Th2型T細(xì)胞分泌,參與B細(xì)胞增殖以及體液免疫[12]。IL-2、IFN-γ 的大量分泌可以下調(diào)體液免疫應(yīng)答。而IL-4、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等細(xì)胞因子可下調(diào)細(xì)胞免疫應(yīng)答[13-14]。以往關(guān)于ASPS影響細(xì)胞因子分泌的研究表明,ASPS對S801白血病細(xì)胞系具有促誘生IFN-γ的效應(yīng)[15];能明顯增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性,并能促進(jìn)刀豆球蛋白(ConA)刺激的小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2[16];10 mg/L ASPS對人淋巴細(xì)胞在ConA刺激下所產(chǎn)生的IFN-α或IFN-γ的效價(jià)均比常規(guī)誘生組高5~7倍,是理想的干擾素促誘生劑[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,ASPS可顯著促進(jìn)IL-2、IFN-γ分泌,而對血清IL-4含量影響不顯著,這與上述以往的研究結(jié)果一致。另外,從本試驗(yàn)結(jié)果還可看出,ASPS提高仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)IL-2和IFN-γ分泌存在劑量依賴關(guān)系,當(dāng)劑量為500~1 000 mg/kg時(shí),能顯著或極顯著提高仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)IFN-γ分泌,800 mg/kg的ASPS能顯著促進(jìn)IL-2分泌,而當(dāng)劑量低于500 mg/kg時(shí),這種影響作用并不顯著。上述結(jié)果提示ASPS可能是通過促進(jìn)IL-2和IFN-γ的分泌而提高機(jī)體的免疫功能的。
在ASPS影響機(jī)體的體液免疫方面,以往有以小鼠為對象的研究報(bào)道,指出ASPS可顯著增強(qiáng)小鼠脾分泌IgM的脾臟抗體形成細(xì)胞(plaque forming cell,PFC),100 mg/kg ASPS 可顯著增強(qiáng)小鼠脾分泌IgG的PFC和小鼠對牛血清蛋白誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)性[18]。從刺五加組織培養(yǎng)的果實(shí)中分離獲得的果多糖可顯著增加分泌IgM的B細(xì)胞數(shù)量[7]。這些基礎(chǔ)研究均指明了ASPS對小鼠體液免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用。而本試驗(yàn)指出ASPS對IL-4分泌及血清IgA、IgM、IgG抗體水平(血清免疫球蛋白含量或效價(jià)高低是反映機(jī)體體液免疫水平的重要指標(biāo),其含量或效價(jià)越高表示機(jī)體的體液免疫水平越高)影響均不顯著,提示ASPS可能對仔豬體液免疫功能無顯著影響,這與上述的以往研究結(jié)果不一致,分析這種結(jié)果的差異可能是研究動(dòng)物小鼠和仔豬的種屬差異所致。
①ASPS能劑量依賴性地增加仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ分泌,對仔豬的免疫功能有改善作用。
②ASPS促進(jìn)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌可能是提高仔豬免疫功能的因素之一。
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動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)2012年12期