汪開毓 苗常鴻 黃錦爐 王 均 連 海 吳春艷 牟巧鳳 付 希

(四川農業(yè)大學魚病研究中心，四川農業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，雅安 625014)

根據水產行業(yè)標準SC/T 1024—2002《草魚配合飼料》，草魚飼料中粗脂肪含量不應小于4%。但是，草魚是一種對脂肪需求量較低的植食性魚類[1-2]。有研究表明，當給草魚投喂脂肪含量為8%的飼料8周后，草魚則出現(xiàn)采食量下降、生長發(fā)育受阻以及血脂升高的現(xiàn)象[3-4]。草魚長期攝入高脂飼料后可導致肝臟脂肪代謝機能紊亂，其病理上可表現(xiàn)為肝臟脂肪異常沉積或肝組織不同程度的損傷[5-6]。然而，草魚長期攝入高脂飼料后引發(fā)其肝臟脂肪代謝異常的作用機制仍不清楚。

作為體內脂肪合成的關鍵酶之一，乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)參與了長鏈脂肪酸從頭合成的第1步反應，其活性高低可直接影響肝臟對脂肪的合成速度，對調控肝組織的脂肪代謝活動具有重要作用[7-8]。因此，研究和分析攝入高脂飼料后草魚的血清生化指標、肝胰臟生化指標以及ACC1 mRNA相對表達量的變化，有助于闡明草魚脂肪代謝的變化機制。本試驗通過連續(xù)12周投喂草魚高脂飼料，以研究高脂飼料對草魚主要生化指標和ACC1 mRNA表達的影響，旨在探索草魚對過量脂肪的代謝調控機理，為系統(tǒng)闡明草魚營養(yǎng)代謝性肝病的發(fā)病機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草魚:購自成都市邛崍水產養(yǎng)殖場。魚油:購自青島永豐生物科技有限公司。大豆油:購自益海嘉里食品營銷有限公司。

1.2 試驗設計與飼料配制

試驗設基礎組和高脂組2組，每組設3個重復，每個重復20尾魚?；A組投喂含4.6%脂肪的基礎飼料，高脂組投喂含8.1%脂肪的高脂飼料。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，飼料中的脂肪比例設計參考 Du等[4]的報道以及 SC/T 1024—2002《草魚配合飼料》，其他營養(yǎng)物質的配比參考NRC(1993)鯉魚的營養(yǎng)需求。

1.3 飼養(yǎng)管理

健康草魚共120尾，平均體重為(15.0±2.4)g，雌雄隨機，購回后用氯化鈉溶液浸泡消毒，分組后以重復為單位馴養(yǎng)在80 cm×75 cm×60 cm的水族箱中，養(yǎng)殖水質符合GB 11607—89《漁業(yè)水質標準》。馴養(yǎng)期間各組均按草魚體重的1% ～2%投喂基礎飼料，每天在09:00、12:00、18:00各投喂1次，每2天換水1次，水源為經曝氣后的自來水，換水量為原來水量的1/4～1/3，換水的同時抽去殘餌和糞便。經2周馴養(yǎng)后，隨機抽取6條草魚，剖解，觀察無異常后開始正式試驗，正式試驗時試驗魚飼喂對應飼料，均按飽食量投喂，試驗期為12周。

1.4 樣本采集與生長相關指標的測定

試驗開始前草魚禁食1 d，從2組中各抽取6尾草魚，稱重后剝離肝胰臟，稱量肝胰臟重量并記錄。分別在正式試驗開始后的第4、8、12周對2組草魚隨機采樣，采樣前草魚禁食1 d，每組各取6尾，稱重、尾靜脈采血后剖解并剝離肝胰臟，將肝胰臟稱重，記錄，計算肝體指數(shù)。

肝體指數(shù)=100×肝胰臟重/魚體重。

1.5 血清相關指標的測定

將采集的血液樣本在室溫下靜置30 min，轉入4℃冰箱放置3 h后4 000 r/min離心10 min，抽取上層血清，同組血清合并為1份，4℃存放，用于甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)含量以及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性的檢測，上述指標檢測所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.6 肝胰臟相關指標的測定

分別從基礎組和高脂組中各取6尾魚，將同組魚的肝胰臟合并，取其中0.2 g，按試劑盒說明制備10%的組織勻漿，用于肝胰臟丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的檢測，上述指標檢測所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。試驗第12周，各組取部分肝胰臟-80℃凍存，用于半定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測ACC1 mRNA的相對表達量。剩余的肝胰臟用福爾馬林溶液固定，制作病理切片后進行蘇木精-伊紅(HE)染色和蘇丹Ⅲ+Ⅳ染色，顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)。

1.7 肝胰臟ACC1 mRNA表達的半定量檢測

1.7.1 引物設計

使用Primer 5.0和Oligo 7.0軟件設計RT-PCR引物(表2)，引物序列參考GenBank公布的草魚ACC1基因序列(登錄號:HM142590)和β-肌動蛋白(β-actin)基因序列(登錄號:DQ211096)進行設計，引物由上海生工公司合成。

表2 RT-PCR引物序列Table2 Primer sequences for RT-PCR

1.7.2 總RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

采用Trizol試劑(TakaRa公司)，提取第12周基礎組和高脂組的草魚肝胰臟總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA提取效果，紫外分光光度計測定吸光度(OD)值，計算RNA濃度以確定上樣量。以提取的總RNA為模板，37℃ 15 min，85℃5 s反轉錄合成cDNA。上述2組的cDNA樣品保存在-20℃冰箱，供RT-PCR使用。

1.7.3 RT-PCR和產物半定量分析

以1.7.2合成的cDNA為模板，RT-PCR擴增ACC1基因片段序列。反應體系共50 μL。ACC1和β-actin基因的反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，退火溫度55.3℃(β-actin基因為59.4 ℃)30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30 個循環(huán);最后72℃延伸5 min。擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，核酸染料(golden view)染色，用Quantity One 462軟件分析條帶豐度，計算ACC1 mRNA的相對表達量。

ACC1 mRNA的相對表達量=ACC1表達豐度/β-actin表達豐度。

1.8 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，高脂組和基礎組數(shù)據進行組間差異t檢驗，同組3個取樣時間的數(shù)據進行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較，結果用平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 草魚肝胰臟組織形態(tài)學觀察

試驗期間，基礎組草魚肝細胞排列整齊，細胞界限清晰，細胞內有少量脂滴(圖1-a、圖1-b)。與基礎組相比，高脂組草魚第4周時肝細胞腫脹，部分肝細胞脂滴增多(圖1-c、圖1-d);第8周時肝細胞進一步腫脹，肝索排列紊亂，肝細胞內空泡體積增大，部分肝細胞核染色質濃縮、邊移，肝細胞內脂滴進一步增多，并相互融合(圖1-e、圖1-f);第12周時脂肪變性進一步加重，肝細胞輪廓不清，部分肝細胞壞死(圖1-g、圖1-h)。

2.2 草魚生長情況

由表3可知，試驗初始階段，高脂組和基礎組草魚體重差異不顯著(P＞0.05)。試驗第4周時，高脂組草魚體重達35.12 g，較基礎組顯著升高了9.2%(P＜0.05);試驗第8周時，高脂組和基礎組草魚體重差異不顯著(P＞0.05);試驗第12周時，高脂組草魚體重為98.62 g，較基礎組顯著降低了11.4%(P＜0.05)。

圖1 12周內草魚肝胰臟組織形態(tài)學觀察Fig.1 Histomorphology observation on hepatopancreas of grass carp within 12 weeks(400×)

試驗初始階段，高脂組和基礎組草魚肝體指數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。試驗第4周時，高脂組草魚肝體指數(shù)為2.51，較基礎組顯著升高了9.1%(P＜0.05);試驗第8周時，高脂組草魚肝體指數(shù)達2.23，但與基礎組差異不顯著(P＞0.05);試驗第12周時，高脂組草魚肝體指數(shù)為2.00，較基礎組顯著降低了13.5%(P＜0.05)。

表3 12周內草魚生長情況Table3 Growth condition of grass carp within 12 weeks

2.3 草魚血清生化指標的變化

投喂高脂飼料后，草魚血清TG、CHO含量均在試驗第4周有不同程度地上升，并在試驗期間保持著上升的趨勢。由表4可知，試驗第4周時，高脂組血清TG含量達2.12 mmol/L，較基礎組顯著升高了89.0%(P＜0.05)。試驗第8、12周的檢測結果顯示，高脂組血清TG含量分別達2.57和2.71 mmol/L，較基礎組分別顯著升高了70.2%和99.2%(P＜0.05)。試驗期間高脂組草魚血清TG含量隨投喂時間的延長逐漸上升，且第4周與第12周之間差異達到顯著水平(P＜0.05)。試驗第4周時，高脂組血清CHO含量已達5.56 mmol/L，較基礎組極顯著升高了78.0%(P＜0.01);試驗第8周時，高脂組血清CHO含量達5.96 mmol/L，較基礎組極顯著升高了81.7%(P＜0.01);試驗第12周時，高脂組草魚血清CHO含量高達6.66 mmol/L，較基礎組極顯著升高了100.6%(P＜0.01)。試驗期間高脂組草魚血清CHO含量隨投喂時間的延長逐漸上升，且3個時間點間差異達到顯著或極顯著水平(P＜0.05或P＜0.01)，試驗第8周時較前1次測定結果顯著升高了7.2%(P＜0.05)，第12周時較前1次測定結果極顯著升高了11.7%(P＜0.01)。

與基礎組相比，高脂組草魚血清AST和ALT活性同樣在試驗第4周有不同程度地上升，并在試驗期間保持上升趨勢。試驗第4周時，高脂組草魚血清ALT和AST活性分別為8.57和12.23 U/L，較基礎組分別極顯著升高了85.5%和188.4%(P＜0.01);試驗第8周時，高脂組草魚血清ALT和AST活性分別為14.69和24.07 U/L，均極顯著高于基礎組3倍以上(P＜0.01);試驗第12周時，高脂組草魚血清ALT和AST活性達66.43和100.31 U/L，均極顯著高于基礎組14倍以上(P＜0.01)。與血清CHO上升趨勢類似，草魚血清ALT和AST活性均隨高脂飼料投喂時間的延長而上升，且3個時間點之間差異達到極顯著水平(P＜0.01)。

2.4 草魚肝胰臟生化指標的變化

由表5可知，試驗第4周時，高脂組草魚肝胰臟MDA含量達3.14 nmol/mg，較基礎組顯著升高了102.5%(P＜0.05);試驗第8周時，高脂組草魚肝胰臟MDA含量達7.61 nmol/mg，約為基礎組的5倍(P＜0.01);試驗第12周時，高脂組草魚肝胰臟MDA含量為8.22 nmol/mg，較基礎組極顯著升高了230.1%(P＜0.01)。試驗期間草魚肝胰臟MDA含量隨高脂飼料投喂時間的延長而持續(xù)上升，3個時間點之間差異達到極顯著 (P＜0.01)。

表4 12周內草魚血清生化指標的變化Table4 Changes in serum biochemical indices of grass carp within 12 weeks

投喂高脂飼料后，草魚肝胰臟SOD活性在試驗第4周達到峰值，之后表現(xiàn)出下降的趨勢。試驗第4周時，高脂組草魚肝胰臟SOD活性為208.00 U/mg，較基礎組顯著升高了16.3%(P＜0.05);試驗第8周時，高脂組草魚肝胰臟SOD活性降至152.56 U/mg，與高脂組第4周的測定結果比較下降了36.3%(P＜0.01)，并顯著低于同期基礎組(P＜0.05);試驗第12周時，高脂組草魚肝胰臟SOD活性為156.22 U/mg，與高脂組第8周的測定結果比較略有上升(上升了2.4%)(P＞0.05)，仍顯著低于同期基礎組(P＜0.05)。

與SOD活性相似，高脂組草魚肝胰臟CAT活性在試驗第4周達到峰值，之后表現(xiàn)出下降的趨勢。試驗第4周時，高脂組肝胰臟CAT活性達625.47 U/g，約為基礎組的30倍，差異極顯著(P＜0.01)。試驗第8周和第12周的檢測結果顯示高脂組草魚肝胰臟CAT活性分別為619.39和290.43 U/g，均極顯著高于同期基礎組14倍以上(P＜0.01)。試驗期間草魚肝胰臟CAT活性隨著高脂飼料投喂時間的延長而下降，試驗第12周時的檢測結果與第8周時相比極顯著降低了113.2%(P ＜0.01)。

表5 12周內草魚肝胰臟生化指標的變化Table5 Changes in hepatopancreas biochemical indices of grass carp within 12 weeks

2.5 草魚肝胰臟ACC1 mRNA表達的變化

2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，RT-PCR產物大小在150 bp以上，膠回收測序結果證實該產物是目的基因的擴增片段(圖2)。經計算，高脂組草魚肝胰臟ACC1 mRNA的相對表達量為1.11，較基礎組極顯著升高了33.7%(P＜0.01，圖3)。

圖2 RT-PCR產物電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of the RT-PCR products

圖3 第12周草魚肝胰臟ACC1 mRNA的相對表達量Fig.3 Relative expression of ACC1 mRNA of grass carp on the week 12

3 討論

3.1 草魚高脂攝入與肝組織損傷

魚類血清中TG和CHO主要源于肝臟的合成，血清中這2項指標的變化可在一定程度上反映肝臟對脂肪的代謝情況[9]。本試驗中，基礎組草魚血清TG和CHO含量分別為1.33和3.24 mmol/L，而高脂組草魚血清TG和CHO含量均隨著投喂時間的延長而升高，試驗第4周、第8周和第12周時這2項指標均顯著或極顯著高于基礎組。有研究表明，飼料中的脂肪能被魚類代謝為游離脂肪酸并被肝臟攝取[10]。Du等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，幼齡草魚攝入高脂飼料6周后血漿TG和CHO含量升高，并出現(xiàn)了類似哺乳動物高脂血癥的癥狀。本試驗中草魚攝入高脂飼料后，同樣出現(xiàn)了血清TG和CHO含量持續(xù)升高的趨勢，這說明投喂12周含8.1%脂肪的高脂飼料使草魚攝入的游離脂肪酸過多，并進一步使肝臟合成的TG和CHO過量。這些過量的TG和CHO被轉運出肝臟，使草魚表現(xiàn)為血脂水平上升。

AST和ALT是存在于肝細胞胞漿內的2種重要轉氨酶，當肝細胞發(fā)生損傷或壞死時這2種轉氨酶釋放入血液，因此血清中ALT和AST活性的異常升高常提示著肝臟已發(fā)生損傷或炎癥[11-12]。在本試驗中，從第4周開始，高脂組草魚血清ALT和AST活性均極顯著高于同期基礎組。試驗期間高脂組草魚血清AST、ALT活性與飼料投喂時間呈正相關關系。肝胰臟組織學觀察結果進一步證實，過量的脂肪攝入使草魚肝細胞在試驗第4周發(fā)生損傷，且在12周內使肝細胞損傷加重。

3.2 草魚高脂攝入與肝胰臟脂質過氧化反應

MDA是脂質過氧化反應產生的最終產物，可在一定程度上反映機體的過氧化程度[11]。脂肪酸在氧化過程中可產生多種氧化應激誘導物，如活性氧(ROS)和自由基，它們既可以直接引起肝細胞損害，又可以通過攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，使肝臟發(fā)生氧化應激并最終產生MDA[13]。在本試驗中，高脂組草魚肝胰臟MDA含量在試驗第4周已顯著高于基礎組，且MDA含量與飼料投喂時間呈正相關關系。這說明，連續(xù)投喂高脂飼料加速了草魚肝臟對脂肪酸的氧化，此期間不斷產生的氧化應激誘導物使MDA持續(xù)生成。

SOD和CAT都是動物機體重要的抗氧化酶，它們可以清除ROS和自由基，保護機體不受損傷，但過量的ROS和自由基可以抑制抗氧化酶的活性，使肝臟出現(xiàn)低抗氧化水平[14-15]。這在本試驗高脂組草魚上也有體現(xiàn):試驗第4周，草魚肝胰臟中SOD和CAT活性分別達到了同期基礎組的2和35倍;第8周時，高脂組這2種抗氧化酶的活性開始下降;到第12周時，這2種抗氧化酶活性均極顯著低于第4周的檢測結果。結合高脂組草魚試驗期間肝胰臟中MDA含量持續(xù)升高的結果，可以推斷在高脂飼料投喂前4周，草魚尚能通過不斷提高肝胰臟中SOD、CAT的活性來清除機體產生的氧化應激誘導物，但過量的誘導物可能在第4周后超過了草魚機體自身的清除能力，并開始抑制機體抗氧化酶的活性。

3.3 草魚高脂攝入后ACC1 mRNA表達的變化

ACC1是肝臟內脂肪酸合成反應的限速酶，其活性的大小可以在一定程度上反映動物對脂肪的合成速率[8]。ACC1 mRNA的表達量受到食物、激素和其他一些生理因子的影響[16]。已有研究證實，哺乳動物進食高脂飼料后ACC1 mRNA的表達量增加，而處于饑餓狀態(tài)時ACC1 mRNA的表達受到抑制[17]。而在魚類上，對ACC1 mRNA表達量的研究較少。Matsumoto等[18]利用高脂飼料建立8周齡青鳉魚的非酒精性脂肪肝模型，8周后發(fā)現(xiàn)試驗魚肝胰臟ACC1 mRNA表達量增加。而Kuwashiro等[19]在相同試驗管理條件下從另一批8周齡青鳉魚上卻發(fā)現(xiàn)試驗魚進食同種高脂飼料8周后肝胰臟ACC1 mRNA表達量下降。本試驗半定量RT-PCR分析結果顯示，投喂高脂飼料12周后草魚肝胰臟ACC1 mRNA相對表達量增加，極顯著高于基礎組，與Matsumoto等[18]的研究結果相符，由此推斷投喂12周的含8.1%脂肪的高脂飼料使草魚肝胰臟ACC1活性上升，加快了草魚體內脂肪酸在肝臟中從頭合成的速度。通過對比 Matsumoto 等[18]和 Kuwashiro 等[19]的試驗可以發(fā)現(xiàn)，魚類ACC1 mRNA表達量的變化除受高脂飼料影響外，還與試驗動物的體質、體內脂肪酸合成和氧化的相互作用有關。本試驗僅選取了草魚體內脂肪酸長鏈合成中的1個限速基因作為研究對象，在后續(xù)的試驗中還可以將更多參與脂肪酸代謝的相關基因納入研究范圍，結合病理形態(tài)學的觀察和相關生化指標的檢測，更全面地研究草魚對過量脂肪酸的代謝模式。

4 結論

高脂飼料的連續(xù)投喂升高了草魚的血脂水平，并使草魚肝胰臟出現(xiàn)損傷，其作用機制可能與高脂飼料降低草魚抗氧化能力以及促進肝臟脂肪合成有關。

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