王傲雪，潘素麗，劉生財，李鳳蘭，王 旭，欒 杰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物工程研究所，福州 350002）

器官或組織的脫落是植物界普遍發(fā)生的生理現(xiàn)象，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化代謝和基因表達等過程共同作用的結(jié)果[1]。一般情況下,把器官或組織脫落的組織區(qū)域及其鄰近部分稱為“離區(qū)”（Abscission zone，AZ），而把此區(qū)域內(nèi)僅發(fā)生組織與細(xì)胞分離的數(shù)層細(xì)胞叫“離層”（Abscission layer）[2]。早在 20世紀(jì)50年代，人們廣泛應(yīng)用菜豆進行離區(qū)解剖學(xué)研究，確定脫落一般發(fā)生在一個可預(yù)知的、由特殊形態(tài)細(xì)胞組成的離區(qū)部位[3]。有些植物的脫落部分在接受誘導(dǎo)前無法辨認(rèn)離層細(xì)胞與其他細(xì)胞的差異[4]，也有研究利用組織化學(xué)和其他技術(shù)辨認(rèn)出離層細(xì)胞的特點[5]。

許多研究表明，纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶等細(xì)胞壁降解酶活性與離區(qū)脫落進程有著密切的關(guān)系[6-10]。國內(nèi)對番茄的離層產(chǎn)生已進行一些研究，但其作用機制尚不十分明確，尤其是有、無離層間纖維素酶與多聚半乳糖醛酸酶等酶的活性變化報道更少，并且離層在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與模式植物研究等方面具有重要價值。許多研究者對植物器官脫落進行深入研究，而對番茄花梗離區(qū)形成過程則關(guān)注較少。

因此，本試驗通過對番茄花發(fā)育過程中離層形成的解剖觀察，對離層的特性及其形成的解剖學(xué)過程進行研究，并以花完全開放時期的離區(qū)為生理生化研究對象，研究番茄花梗脫落區(qū)發(fā)育過程中相關(guān)細(xì)胞壁降解酶含量的變化，為進一步探討離區(qū)發(fā)育機制奠定理論基礎(chǔ)，也為生產(chǎn)中防止落花落果提供重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2009年2～7月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站進行，以番茄離層品種“08052”、“09872”、“09874”和無離層品種“08003”、“08004”、“08016”為試材，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供，日光溫室栽培。當(dāng)番茄開第2穗花時開始取樣，于每天上午9:00左右剪取各株相同或相近位置花序上正常開放的花，放入盛有蒸餾水的燒杯中，立即帶回實驗室，先用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗3次。取有離層品種離區(qū)上下2 cm作為提取材料，無離層品種在相應(yīng)部位2 cm處取材。

1.2 方法

1.2.1 離層發(fā)育過程解剖學(xué)研究

在6葉1心時取有離層品種“9872”（T）和對照無離層品種“08003”（CK），每7 d取其生長點，至花絮出現(xiàn)時取其花絮，待花完全開時取其花梗，均用FAA固定。利用石蠟切片技術(shù)處理所取樣品（切片厚度為10 μm）經(jīng)過番紅-固綠滴染后封固[11]，用Olympus-BMF光學(xué)顯微鏡觀察并選擇典型的結(jié)構(gòu)進行拍照。

1.2.2 生理生化指標(biāo)的測定

根據(jù)離層發(fā)育過程解剖學(xué)觀察結(jié)果，在完全形成離層的時期（花完全開放時期）進行取材，測定相關(guān)的生理生化指標(biāo)。

多聚半乳糖醛酸酶：0.6%柑橘果膠為反應(yīng)底物，每克組織每小時內(nèi)黏度下降1%作為一個Exo-PG酶活單位[12]。

纖維素酶：羧甲基纖維素鈉為底物，采用3，5-二硝基水楊酸比色法[13]。以每小時生成1 mg的還原糖作為1個酶活單位。

果膠甲酯酶：0.5%果膠溶液為底物，采用吸光光度法測量，一個酶活力單位被定義為每分鐘釋放1 μmol的甲酯所需要的酶量。

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測定。

數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄花梗離區(qū)過程解剖學(xué)分析

番茄種子發(fā)芽后，繼續(xù)保持營養(yǎng)生長，當(dāng)長到7～8片真葉時，生長點就停止了葉的分化開始進入花芽分化。由圖版Ⅰ-1和Ⅰ-2可以看出，這時期的芽還不能分辨出是花芽還是葉芽，且有離層品種與無離層品種間也無差別。

由于花芽芽體肥大飽滿，頂端圓鈍，而葉芽則芽體較小，頂端細(xì)長。由圖版Ⅰ-3和Ⅰ-4可看出，此時的生長點呈圓錐形突起，且生長點頂部肥厚隆起，上端扁平，此時的芽原基開始形成花芽，植株進入花芽分化初期，開始從營養(yǎng)生長時期轉(zhuǎn)入到生殖生長時期。在花芽分化初期離層分化不明顯，基本上還未開始進行離層的分化。

當(dāng)番茄花芽分化進入中期時，無離層品種的花芽梗和有離層品種的花芽梗在解剖學(xué)有一定差異。由圖版Ⅰ-5和Ⅰ-6可以看出，無離層品種花芽梗中部發(fā)育平滑無任何斷帶，而有離層品種花芽梗中部有一條隱約可見的斷帶。

隨著花的發(fā)育，當(dāng)番茄花芽分化進入后期時，無離層品種花梗細(xì)胞排列都非常有序，并無斷層出現(xiàn)（見圖版Ⅰ-7）；而有離層品種花梗中部的斷帶也變得清晰可見（見圖版Ⅰ-8），這說明離層也是隨著花的發(fā)育而逐步形成的。

當(dāng)番茄花完全開放時（見圖版Ⅰ-9和Ⅰ-10），無離層品種的花梗細(xì)胞排列緊密有序并無斷層出現(xiàn)（見圖版Ⅰ-11）；而有離層品種的花梗發(fā)育膨大，離層凹陷變得更明顯且斷帶更加清晰，斷帶是由比周圍小而且密的細(xì)胞組成的，此斷帶就是我們所說的離層（見圖版Ⅰ-12）。而且從植株外觀上可以看出，有離層品種花梗上有膨大的結(jié)，中央有一圈凹陷，此區(qū)域就是離區(qū)（見圖版Ⅰ-12），但無離層品種的花梗沒有這種結(jié)（見圖版Ⅰ-11）。

2.2 花梗離區(qū)部位生理指標(biāo)的測定

2.2.1 有離層品種與無離層品種離區(qū)部位多聚半乳糖醛酸酶含量的差別

多聚半乳糖醛酸酶與離層的產(chǎn)生有著重要關(guān)系。由圖1可知，不僅無離層品種（08003、08004、08016）間多聚半乳糖醛酸酶含量差異不顯著，而且離層品種（08052、09872、09874）間多聚半乳糖醛酸酶含量差異也不顯著。然而離層品種多聚半乳糖醛酸酶活性顯著高于無離層品種，說明多聚半乳糖醛酸酶含量高可以促使離層的產(chǎn)生。

圖版I 有離層品種與無離層品種離區(qū)解剖結(jié)構(gòu)對比Plate I Abscission zone anatomy structural comparison between cultivars with and without abscission layers

圖1 有離層品種與無離層品種離區(qū)部位多聚半乳糖醛酸酶活性Fig.1 Poly-galacturonic acid activity in abascission zone of cultivars with and without abscission layers

2.2.2 有離層品種與無離層品種花梗的纖維素酶含量的差別

纖維素酶在細(xì)胞壁的酶解進程中起著重要作用，從而促使離層的產(chǎn)生。由圖2可知，無論是無離層品種（08003、08004、08016），還是離層品種（08052、09872、09874），它們的纖維素酶活性差異均不顯著。然而離層品種與無離層品種的纖維素酶活性差異顯著，且離層品種花梗的纖維素酶活性顯著高于無離層品種。

2.2.3 有離層品種與無離層品種離區(qū)部位果膠甲酯酶活性的差別

果膠甲酯酶的作用是去除果膠分子鏈上半乳糖醛酸基上的酯化基團，增加果膠在水中的溶解度，降解細(xì)胞壁。由圖3可知，同花梗的纖維素酶活性一樣，無離層品種（08003、08004、08016）間果膠甲酯酶活性差異不顯著，離層品種（08052、09872、09874）間果膠甲酯酶活性差異顯著。然而離層品種與無離層品種中的果膠甲酯酶活性呈差異顯著，且其活性明顯高于無離層品種。

2.2.4 有離層品種與無離層品種可溶性蛋白含量的差別

由圖4可知，雖然無離層品種（08003、08004、08016）間可溶性蛋白含量差異顯著，有離層品種（08052、09872、09874）間的可溶性蛋白含量差異不顯著。但無離層品種可溶性蛋白含量要高于有離層品種。

圖2 有離層品種與無離層品種離區(qū)部位纖維素酶活性Fig.2 Ce11u1ase activity in the abascission zone of cultivars with and without abscission layers

圖3 有離層品種與無離層品種離區(qū)部位果膠甲酯酶活性Fig.3 Pectin methylesterase activity in the abscission zone of cultivars with and without abscission layers

圖4 有離層品種與無離層品種離區(qū)部位可溶性蛋白含量Fig.4 Content of soluble protein in the abscission zone in cultivars with and without abscission layers

3 討論與結(jié)論

脫落與離層密切相關(guān)，器官的脫落必有離層的產(chǎn)生，但有離層的器官不一定會有脫落現(xiàn)象的發(fā)生。由本試驗可以看出，離層始終是伴隨著花的產(chǎn)生，花的開放乃至結(jié)果。分化程度作為一種重要的脫落前提存在[14-15]。

由解剖圖片可知，離層是由數(shù)層小細(xì)胞組成的一個完整的貫穿整個花梗部位的細(xì)胞層。曾經(jīng)有人認(rèn)為離層就是原本脆弱的連接點，后來經(jīng)過測定誘導(dǎo)初期脫落器官或組織的折斷強度變化，發(fā)現(xiàn)事實并非如此[16]。在試驗取材、處理材料的過程中，花梗的離層處基本上都不斷裂，這點證明了離層并不是脆弱的連接點。對多種園藝植物花器離區(qū)的解剖顯示，不同植物花器離層細(xì)胞大小有3種類型：①離層細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小，大多等徑[17]，②離層細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小，大多長方形；③離層細(xì)胞大小與相鄰細(xì)胞近似[18]。不同植物細(xì)胞大小為何不同，到底有何作用尚需要進一步探討。

本試驗先通過解剖學(xué)來初步認(rèn)識和了解離層的產(chǎn)生過程，通過測定加工番茄花期離層部位生理生化各指標(biāo)的差異來進一步研究細(xì)胞壁降解酶及可溶性蛋白對離區(qū)的影響。由試驗可知，無離層品種（08003、08004、08016）間的各細(xì)胞壁降解酶活性差異不顯著，且其活性較低，說明無離層品種花梗部位該酶的表達量較少，未達到對花梗細(xì)胞產(chǎn)生影響。離層品種（08052、09872、09874）間的細(xì)胞壁降解酶的活性個別有差異性，這是品種所特有的差異造成的。但這并不影響與無離層品種的對照研究，PG、纖維素酶和果膠甲酯酶的活性在離層品種中是在無離層品種中活性的5倍左右，正是由于離層品種中有如此高活性的酶作用于離區(qū)細(xì)胞，所以能夠清晰看到與周圍細(xì)胞不同的離層。此外研究者認(rèn)為，花梗離層是由復(fù)雜的細(xì)胞壁降解酶系統(tǒng)共同作用結(jié)果，非由少數(shù)幾種酶單獨完成[19]，了解這個酶系統(tǒng)的成員及其作用順序是了解離層特性的必要步驟。

本試驗所測的有無離層品種可溶性蛋白含量的變化趨勢完全與酶活含量相反，可溶性蛋白的含量與細(xì)胞壁降解酶的活性呈負(fù)相關(guān)，其原因有待于進一步研究。

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