吳海濤

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046）

長期以來，脂肪組織被認(rèn)為是惰性組織，主要致力于能量儲(chǔ)存與釋放。近年的研究表明，脂肪組織不僅參與內(nèi)分泌和免疫調(diào)控，還含有具備多向分化潛能的多能干細(xì)胞。2004年國際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會(huì) （International Fat Applied Technology Society）將此干細(xì)胞命名為脂肪來源干細(xì)胞（Adipose-derived Stem Cell，ASC）[1]，因?yàn)閬碓从谥信邔娱g充質(zhì)，也常將其稱為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell，AMSC）。

目前常用的干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。因?yàn)槊媾R倫理、法律和政治爭議，人體胚胎干細(xì)胞一般不可用于當(dāng)前的醫(yī)療實(shí)踐。中胚層來源的骨髓干細(xì)胞是最早研究的成體多能干細(xì)胞，已廣泛用于組織工程，但它來源有限，抽取骨髓時(shí)有疼痛，而且從骨髓組織中提取的干細(xì)胞比例非常低（大約每105個(gè)黏附間質(zhì)細(xì)胞可獲得1個(gè)干細(xì)胞）；臍帶血干細(xì)胞也屬于成體多能干細(xì)胞，其分化潛能低于骨髓干細(xì)胞，且需要長期保存；而脂肪干細(xì)胞可以從脂肪組織抽吸物中大量分離獲取，而且容易培養(yǎng)、生長速度快、衰老也比骨髓干細(xì)胞慢，另外，其致病性低、分化穩(wěn)定、移植安全的特點(diǎn)使其成為基礎(chǔ)和臨床研究中理想的成體干細(xì)胞。

1 脂肪干細(xì)胞的分離

吸脂術(shù)產(chǎn)生的脂肪吸取物是自體ASC的理想來源，從脂肪吸取物原代培養(yǎng)得到的細(xì)胞稱為脂肪基質(zhì)微管碎片細(xì)胞（SVF），這種細(xì)胞不僅含有脂肪干細(xì)胞，還包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等[2]。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，ASC 通過與塑料培養(yǎng)皿粘附而與其它細(xì)胞分離[3]，但是成纖維細(xì)胞也會(huì)和塑料培養(yǎng)皿壁粘附，所以，一些批評(píng)意見指出，如果存在造血干細(xì)胞污染，那么細(xì)胞分化的來源就不是單一的。

2 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)特性

骨髓干細(xì)胞對(duì)胎牛血清的來源和質(zhì)量有嚴(yán)格要求，而脂肪干細(xì)胞在添加任何批號(hào)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中均能很好地?cái)U(kuò)增，細(xì)胞形態(tài)成纖維狀，傳代培養(yǎng)平均倍增時(shí)間為60小時(shí)，并且保持穩(wěn)定的倍增率直至13～15 代，其中衰老和死亡細(xì)胞的比例也很低，這表明ASC 體外擴(kuò)增能力很強(qiáng)，易于獲得大量有分化能力的細(xì)胞。但是Rubio 等人發(fā)現(xiàn)[4]，人類ASC 連續(xù)增殖傳代超過4個(gè)月后，將出現(xiàn)惡變現(xiàn)象，提示新提取的ASC 較培養(yǎng)傳代后的ASC 更安全、更適合用于臨床。

3 脂肪干細(xì)胞表面的分子標(biāo)記

特異性細(xì)胞表面的分子標(biāo)記有助于ASC的純化、鑒定以及進(jìn)一步研究，但大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ASC 細(xì)胞表面分子標(biāo)記存在異質(zhì)性[5]，不同研究小組報(bào)道的分子標(biāo)記有差異，這與ASC 細(xì)胞純化和培養(yǎng)方法不同以及分子標(biāo)記檢測(cè)時(shí)細(xì)胞處于不同的階段有關(guān)。

大多數(shù)研究人員通過原代培養(yǎng)得到的SVF 細(xì)胞是異源的細(xì)胞混合物，其中的ASC 會(huì)通過和塑料培養(yǎng)皿壁粘附而與其他細(xì)胞分離，所以伴隨細(xì)胞生長、傳代，造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記CD11、CD14、CD45 會(huì)逐步喪失[6]；而利用塑料培養(yǎng)皿進(jìn)行ASC培養(yǎng)時(shí)，一些分子標(biāo)記也極易發(fā)生變化，比如粘附分子；研究還表明ASC 和骨髓干細(xì)胞有相似的分子標(biāo)記[7]，一些骨髓干細(xì)胞分子標(biāo)記也可以作為ASC的分子標(biāo)記，比如STRO1、CD73[8]，但是它們?nèi)匀徊皇翘禺愋苑肿訕?biāo)記。不過已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ASC細(xì)胞是SVF 細(xì)胞中的CD34+、CD31-細(xì)胞群[9]。但目前ASC 細(xì)胞仍然只能通過功能實(shí)驗(yàn)或者后續(xù)的分化結(jié)果加以確切鑒定。

4 脂肪干細(xì)胞的多向誘導(dǎo)分化

多能ASC 細(xì)胞可以分化為多種中胚層來源的細(xì)胞類型，包括骨骼肌、心肌、軟骨、脂肪、成骨等分化方向，其中心肌分化的重復(fù)性和產(chǎn)量是最低的[10]。在軟骨分化方面，ASC 不如骨髓干細(xì)胞有效[11]。來源于中胚層的脂肪干細(xì)胞分化為外胚層起源的神經(jīng)細(xì)胞[12]和內(nèi)胚層起源的胰腺表型細(xì)胞[13]是非常令人驚奇的，而且脂肪干細(xì)胞可能還有助于血管[14]和造血細(xì)胞的生成[7]。

ASC 在不同成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其生長和分化存在極大的差異，比如牛血清促進(jìn)細(xì)胞生長，馬血清則有助于細(xì)胞分化；轉(zhuǎn)化生長因子β、纖維生長因子2 增強(qiáng)ASC 細(xì)胞增殖卻對(duì)分化沒有作用，表皮生長因子被證實(shí)是抗分化因子；體外ASC 向不同細(xì)胞類型分化依賴于培養(yǎng)基中不同的添加劑，比如在含有地塞米松、β-甘油磷酸鈉、L-谷氨酰胺和維生素C的培養(yǎng)基中，ASC 經(jīng)過3～4周培養(yǎng)可以產(chǎn)生成骨反應(yīng)；添加胰島素、地塞米松、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤的DMEM 培養(yǎng)液，可誘導(dǎo)ASC分化為脂肪細(xì)胞，其它分化方向的誘導(dǎo)條件見表1。另外，在組織工程領(lǐng)域，理想的支架有利于細(xì)胞貼附、生長和分化，最終形成組織。比如結(jié)合于膠原微球支架的ASC 可以表現(xiàn)出成骨與成脂方向的分化與增殖[15]，結(jié)合有硫酸軟骨素的聚乙二醇水凝膠也被應(yīng)用于促進(jìn)ASC分化為軟骨細(xì)胞[16]。

5 脂肪干細(xì)胞的應(yīng)用研究

體外擴(kuò)增的ASC 與生物材料結(jié)合，是實(shí)現(xiàn)修復(fù)較大器官組織缺損，重建缺損部位生理功能的新途徑。但是目前脂肪干細(xì)胞的應(yīng)用研究多是個(gè)案報(bào)道，臨床研究也處于Ⅰ期臨床的早期。以下對(duì)脂肪干細(xì)胞在不同方向的應(yīng)用研究作簡要闡述。

ASC 在分化為脂肪細(xì)胞的同時(shí)，還有助于血管生成，可以明顯提高脂肪移植后的長期存活率，ASC的成脂分化在面部輪廓整形、除皺等軟組織重建中發(fā)揮著重要的作用。

成熟脂肪細(xì)胞及其前體細(xì)胞均表達(dá)單純皰疹病毒的受體，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明復(fù)制缺陷的單純皰疹病毒可以有效轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，攜帶的外源基因在脂肪細(xì)胞中亦能穩(wěn)定表達(dá)。故以脂肪細(xì)胞為靶細(xì)胞，復(fù)制缺陷單純皰疹病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有可能成為基因治療的一種方式[17]。

ASC的成骨分化，在臨床上可用于骨折和關(guān)節(jié)植骨融合的治療。2003年首次實(shí)驗(yàn)證明將體外成骨分化后的大鼠ASC，重新植入皮下，8周后有骨骼形成[18]；2004年德國MacroPore Biosurgery 公司與德國Giessen 大學(xué)聯(lián)合對(duì)外公布了一項(xiàng)使用脂肪干細(xì)胞治療一名七歲女孩顱骨缺損的臨床報(bào)告。在這項(xiàng)手術(shù)中，因骨傷面積接近120 cm2，髂嵴來源的骨數(shù)量有限，自體脂肪組織干細(xì)胞被加入到患者髂嵴移植骨，然后均勻地敷在顱骨缺損部位，并固定兩片可降解的MacroPoreTM 保護(hù)膜，3個(gè)月后CT分析顯示新骨形成，并且顱骨創(chuàng)傷區(qū)周圍顱頂幾近完全連續(xù)[19]。

Rodriguez 等將正常人ASC 移植到Duchenne 型肌營養(yǎng)不良模型小鼠（抗肌營養(yǎng)不良蛋白缺陷）的脛骨前肌，6個(gè)月后，90%的脛骨前肌檢測(cè)到抗肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)，50天時(shí)，在相鄰腓腸肌發(fā)現(xiàn)由脛骨前肌遷移而來的抗肌營養(yǎng)不良蛋白陽性肌纖維[20]。

注射ASC 到裸鼠缺血的后肢，后肢血流量和毛細(xì)血管密度明顯增加[14]。這和ASC分泌血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子β[14]等血管生成因子有關(guān)，不太可能是ASC直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。有報(bào)道指出，使用自體脂肪移植治療20 位放療后期因慢性組織缺血導(dǎo)致并發(fā)癥的患者，都表現(xiàn)出新血管形成等進(jìn)行性組織再生現(xiàn)象[21]。盡管機(jī)制仍不明了，但這種方法也有可能用于治療微血管病變。

ASC 能表達(dá)、分泌巨噬細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等造血相關(guān)細(xì)胞因子[7]。2003年報(bào)道腹腔注射ASC 可以挽救40%被輻射小鼠的生命，雖然效果較骨髓干細(xì)胞慢，但存活率和骨髓干細(xì)胞一樣；文章分析認(rèn)為，ASC 促進(jìn)了骨髓造血干細(xì)胞的增殖[22]，不過脂肪干細(xì)胞靜脈注射會(huì)出現(xiàn)輻射小鼠死亡[22]的現(xiàn)象。

脂肪干細(xì)胞用于治療復(fù)發(fā)性克羅恩瘺（recurrent Crohn’s f istulae）的Ⅰ期臨床已在馬德里L(fēng)aPazUniversityHospital 進(jìn)行[23]，4位患者的9 處瘺管進(jìn)行自體ASC 接種治療，在每周隨訪的8 處瘺管中，6 處瘺管（75%）在8周內(nèi)完全治愈，無副作用發(fā)現(xiàn)，更多評(píng)價(jià)還有待于Ⅱ期臨床試驗(yàn)的進(jìn)行。

6 ASC 研究需要解決的問題

盡管有報(bào)道稱ASC 用于人體是安全的[24]，但是，也有研究指出植入ASC 會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制[19]，顯然這個(gè)問題需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

除此之外，以下一些問題的解決將有助于ASC 在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。首先，特異性分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)可以從根本上改變ASC 細(xì)胞的純化和鑒定。其次，要建立可靠、快速、有效的細(xì)胞分化方案。ASC 脂肪分化大約需要兩周時(shí)間，成骨和軟骨分化時(shí)間更長且分化的細(xì)胞數(shù)量少。改進(jìn)現(xiàn)有分化方法可從以下方面進(jìn)行：不同細(xì)胞因子和生長因子的應(yīng)用、利用可靠有效的生物材料進(jìn)行3-D 培養(yǎng)、更清楚了解細(xì)胞分化相關(guān)的受體配體以及細(xì)胞外基質(zhì)成分等。另外無血清細(xì)胞培養(yǎng)和分化方法的建立、可靠穩(wěn)定的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也是ASC 臨床應(yīng)用需要解決的問題。

令人鼓舞的是上述很多問題正在被解決，所以ASC 在未來臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用是令人期待的。

表1 ASC 向特異的細(xì)胞譜系分化的誘導(dǎo)條件

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