楊 昊，魯 紅，陳發(fā)明，金 巖

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安710032)

牙周病治療中牙周缺損的修復(fù)是國(guó)際關(guān)注的難題。傳統(tǒng)的牙周治療方法雖然能有效控制牙周病的發(fā)展進(jìn)程，但卻不能使缺失的牙周支持組織再生。自2004年美國(guó)施松濤教授發(fā)現(xiàn)人牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)以來(lái)，使干細(xì)胞治療為牙周組織再生帶來(lái)了新的希望，有望成為未來(lái)牙周病治療的重要手段［1］。而引導(dǎo)組織再生術(shù)(guide tissue regeneration，GTR)作為牙周病治療的主要方法［2］，是在牙周手術(shù)中利用膜性材料作為屏障，阻擋牙齦上皮在愈合過(guò)程中沿根面生長(zhǎng)，引導(dǎo)具有形成新附著能力的牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)優(yōu)先占領(lǐng)根面，形成新的附著性愈合。由此可見(jiàn):生物膜材料的阻擋作用和生物相容性對(duì)GTR具有重要影響［3］。Bio－Gide生物膜是瑞士Geistlich Pharma AG集團(tuán)有限公司的產(chǎn)品，已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用，其為組織再生提供空間的機(jī)械屏障作用已被充分認(rèn)可［4－6］，但作為細(xì)胞載體材料，特別是與PDLSCs的結(jié)合及其附著能力的研究尚少，而細(xì)胞載體的研究在牙周組織工程研究中具有重要的地位和作用［7］?？紤]到該材料具有長(zhǎng)期臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，如果能夠?qū)⑵渥鳛榧?xì)胞載體，應(yīng)用于牙周組織工程和細(xì)胞治療中，將加速臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)程。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)Bio－Gide在牙周再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，本研究通過(guò)觀察人PDLSCs在Bio－Gide生物膜材料上的粘附生長(zhǎng)情況，為其作為有效的細(xì)胞載體用于牙周組織工程治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

Bio－Gide生物膜(Geistlich Pharma AG，瑞士);α－MEM 培養(yǎng)基、L－谷氨酰胺、青、鏈霉素、(Gibco公司，美國(guó));胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程有限公司);2.5 g/L胰蛋白酶(Amresco，美國(guó));Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國(guó));地塞米松、β－甘油磷酸鈉、異丁基甲基黃嘌呤IBMX、抗壞血酸(Sigma，美國(guó));抗 CD31、抗 CD34、抗 CD45、抗 CD90、抗CD105、抗 CD29、抗 CD146、抗 STRO－1 抗體(R＆D Systems，美國(guó));茜素紅、油紅O、二甲基亞砜DMSO(Sigma公司，美國(guó))。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國(guó));離心機(jī) (Kubota2l00，日本);YJ－875型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)(OlympusIX70，日本);體視顯微鏡(Olympus，日本);掃描電鏡(日立 S－4800，日本);6孔培養(yǎng)板、24孔板、平底96孔板(Falcon，美國(guó));10 cm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，Lowell，美國(guó));流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，美國(guó));超聲震蕩儀(上海生源器械廠);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO－TEK，美國(guó));紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國(guó))。

1.2 人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 牙周膜干細(xì)胞的原代培養(yǎng)

選取5名年齡16～45歲健康(否認(rèn)全身性疾病)志愿者(知情同意)拔除無(wú)牙周病的第三磨牙(上頜4個(gè)，下頜5個(gè))，立即在超凈工作臺(tái)內(nèi)刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm并移入離心管內(nèi)，以 I型膠原酶在37℃下消化15 min后接種于6孔板中，置蓋玻片并滴加含100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng)基，置 37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)10～15 d，每2天換液1次。待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并達(dá)到80%匯合時(shí)，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 牙周膜干細(xì)胞的分離、純化

有限稀釋法克隆分離PDLSCs:取上述細(xì)胞用α－MEM制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為10/mL以下，接種于 96孔板，每孔 0.1 mL，在 37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后顯微鏡下觀察并標(biāo)記含單個(gè)細(xì)胞孔，補(bǔ)加0.1 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2天換液。當(dāng)細(xì)胞形成克隆(集落細(xì)胞數(shù)≥50)并長(zhǎng)至孔底1/2時(shí)，胰蛋白酶消化，擴(kuò)大培養(yǎng)，即為PDLSCs。

1.2.3 PDLSCs的鑒定

1.2.3.1 細(xì)胞克隆形成能力的檢測(cè)

取克隆純化的第4代細(xì)胞用胰酶消化后用α－MEM制成單細(xì)胞懸液，以1×103個(gè)細(xì)胞接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，十字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻后置37℃的CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。14 d后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min，PBS浸洗2遍，甲苯胺藍(lán)染色20 min，PBS洗2遍，顯微鏡下觀察并拍照。以多于50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)為一個(gè)克隆，并計(jì)算克隆形成率。

1.2.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取克隆純化的第4代細(xì)胞用胰蛋白酶消化后用α－MEM制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL后接種于 96 孔板，每孔 200 μL，置37℃，50 mL/L CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。24 h后每孔加5 mg/mL的MTT液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加160 μL DMSO振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)各孔490 nm處的吸光值(OD值)。并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3.3 干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)

取克隆純化的第4代細(xì)胞胰酶消化后用α－MEM制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL后用含30 mL/L FBS的PBS洗2遍，裝入EP管中，分別加入適當(dāng)量的 CD90、CD105、CD29、STRO－1、CD146、CD31、CD34、CD45 抗體于4℃冰箱中孵育。1 h后用含3 mL/L FBS的PBS洗去抗體，用流式細(xì)胞儀在避光條件下進(jìn)行抗體檢測(cè)。其中STRO－1是Alexa Fluor647標(biāo)記;CD45、CD146、CD90、CD31 為 PE 標(biāo)記;CD105、CD29、CD34為FITC標(biāo)記。

1.3 Bio－Gide生物膜的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 Bio－Gide 生物膜浸提液的制備

參照GB/T 16886.5醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分細(xì)胞毒性試驗(yàn)體外法，將Bio－Gide生物膜用Co60射線消毒后切成5 mm×25 mm，按3 cm2/mL的比例加入含100 mL/L的FBS的 α－MEM培養(yǎng)液，于37℃下浸提24 h，取浸提液用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT 法測(cè)細(xì)胞毒性

取克隆純化的第4代細(xì)胞用胰蛋白酶消化后用α－MEM制成細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞密度為1×104/mL接種于 96孔板，每孔 200 μL，置 37℃、50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄原液，將細(xì)胞隨機(jī)分為2組，每組8孔，其中對(duì)照組加入200 μL的 α－MEM 培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入200 μL的Bio－Gide生物膜浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天時(shí)，于各組各孔加入20 μL MTT液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加160 μL的DMSO，低速震蕩10 min后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD值)，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以下列公式計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率(RGR)。

并根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)將RGR值轉(zhuǎn)換成6級(jí)反應(yīng)(表1)，以評(píng)定材料的毒性程度:0、1級(jí)為合格;2級(jí)應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)分析，綜合評(píng)價(jià);3～5級(jí)為不合格。

表1 RGR值轉(zhuǎn)換6級(jí)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)

1.4 PDLSCs在 Bio－Gide生物膜上生長(zhǎng)、粘附情況觀察

1.4.1 掃描電鏡觀察生長(zhǎng)情況

將 Bio－Gide生物膜剪成1.5×1.5 cm 后置24孔板中。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代PDLSCs，胰蛋白酶消化并用α－MEM制成細(xì)胞密度為1×106/mL的細(xì)胞懸液后接種于生物膜片上常規(guī)培養(yǎng)，在培養(yǎng)后8 h、1、3、7、12 d 時(shí)中止培養(yǎng)，取生物膜片用固定液固定后，電鏡樣本制備常規(guī)掃描并觀察拍照。

1.4.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的粘附情況

將生物膜剪成1.5×1.5 cm后置24孔板中，同時(shí)設(shè)不放生物膜的孔作為對(duì)照，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代PDLSCs用含100 mL/L FBS的α－MEM制成細(xì)胞密度為1×106/mL的細(xì)胞懸液后接種于上述24孔板中，每孔1 mL，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后于各組各孔滴加Hochest熒光核染色劑，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，吸取上清液，熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)(實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次)，以下列公式計(jì)算細(xì)胞粘附率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人PDLSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

本研究參照課題組前期報(bào)道［8］，采用酶消化組織塊法培養(yǎng)人PDLCs，一般10 d左右可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，大約3周左右原代細(xì)胞達(dá)80%匯合。可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，有細(xì)胞突觸，胞核聚集在中心，具有成體干細(xì)胞的特征(圖1)。培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞在7 d左右出現(xiàn)克隆集落，呈旋渦狀生長(zhǎng)，集落內(nèi)細(xì)胞密度隨時(shí)間逐漸增加，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞突起明顯(圖2)。14 d時(shí)計(jì)算克隆形成率為(12.9±0.6)%。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本成S形，第2天與第1天比較無(wú)明顯增殖，第3天開(kāi)始基本成對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，第7天時(shí)細(xì)胞增殖進(jìn)入平臺(tái)期(圖3)。通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)，對(duì)造血系標(biāo)志物CD34、CD45和內(nèi)皮系標(biāo)志物CD31表達(dá)陰性;而高表達(dá)一系列干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO－1、CD146、CD105、CD29、CD90(圖 4)。其中 STRO－1是 11.9%，CD146是 45.5%，CD105是 92.1%，CD29是99.5%，CD90是 100%，CD34是 0.7%，CD45 是1.9%，CD31 是0.2%。

圖1 牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)10 d(×40)

圖2 14 d時(shí)單細(xì)胞克隆(×15)

圖3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組吸光度均值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，其增殖率 RGR=122.66%(表2)。根據(jù)表1評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)其毒性級(jí)為0級(jí)，無(wú)毒性。

表2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=8)

2.3 掃描電鏡觀察PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的生長(zhǎng)情況

Bio－Gide生物膜的基本組成成分Ⅰ型和Ⅲ型膠原，電鏡下可見(jiàn)粗大的膠原纖維束(圖5a)。通過(guò)對(duì)生物膜上不同時(shí)段細(xì)胞的觀察，可看到細(xì)胞在生物膜上有很好的貼附生長(zhǎng)，8 h觀察細(xì)胞在生物膜上已經(jīng)附著并伸展呈長(zhǎng)梭形及多角形，部分細(xì)胞成短梭形(圖5b)。而24 h細(xì)胞已經(jīng)完成貼壁，視野中均為長(zhǎng)梭形細(xì)胞，高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞附著較密集，細(xì)胞與細(xì)胞間有空隙，可見(jiàn)下層的膠原束(圖5c)。3 d時(shí)細(xì)胞增殖較多，匯合成片狀，基本覆蓋細(xì)胞下方的膠原束(圖5d)，但在低倍鏡下仍可見(jiàn)不同的膠原層次(圖5e)。7 d時(shí)細(xì)胞已經(jīng)完全成膜狀生長(zhǎng)，低倍鏡下觀察，生物膜表面呈平滑狀，膠原束已經(jīng)完全被細(xì)胞膜遮擋，膜表面可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的片狀紋理，少數(shù)細(xì)胞膜片之間未完全融合留有裂隙(圖5f)。12 d時(shí)在低倍鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密集，形成的膜片較7 d時(shí)增厚，細(xì)胞膜片之間的裂隙也明顯減少(圖5g)。

2.4 PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的粘附情況

將與生物膜共同培養(yǎng)的PDLSCs上清液用Hochest熒光核染色劑染色后，熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組上清液中細(xì)胞數(shù)為(13.3±3.4)×104，其細(xì)胞粘附率為(86.7 ±3.4)%，明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)(表3)。

圖5 PDLSCs在生物膜上培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)掃描電鏡觀察

表3 PDLSCs在Bio－Gide生物膜上的粘附情況(n=8)

3 討論

牙周治療的最終目標(biāo)，是實(shí)現(xiàn)牙周支持組織的功能性再生，傳統(tǒng)的治療方法雖能有效控制牙周病的發(fā)展過(guò)程，但卻不能達(dá)到牙周組織再生的目的。GTR技術(shù)的應(yīng)用大大提高了牙周治療的臨床效果，但其與真正的牙周支持組織的生理性和功能性再生還有一定的距離。

近年來(lái)，組織工程的發(fā)展為牙周缺損的治療帶來(lái)了新的思路，其基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度、功能相關(guān)的活細(xì)胞種植于具有良好生物相容性和生物降解性的細(xì)胞外基質(zhì)材料上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，將這種細(xì)胞與生物材料復(fù)合體植入機(jī)體病損部位，以形成新的具有原來(lái)特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)組織和器官，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。而牙周膜干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)又為牙周組織工程的構(gòu)建提供了理想的細(xì)胞來(lái)源。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:利用牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行牙周組織的細(xì)胞治療，均能實(shí)現(xiàn)較為理想的牙周缺損組織的生理性和功能性再生［9－11］。而在利用組織工程技術(shù)進(jìn)行牙周治療的過(guò)程中，細(xì)胞載體的運(yùn)用起著重要的鏈接作用，但目前還沒(méi)有一種可供臨床應(yīng)用的良好細(xì)胞載體，因此大大延緩了牙周組織工程(特別是細(xì)胞治療)基礎(chǔ)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

在GTR和骨再生手術(shù)中得到廣泛應(yīng)用的Bio－Gide生物膜是瑞士蓋氏骨替代品產(chǎn)品，該生物膜主要由致密層和疏松層組成。致密層主要是阻止軟組織長(zhǎng)入植骨區(qū)域，疏松層主要是容納血細(xì)胞和成骨細(xì)胞，使骨膜能與植骨區(qū)更易貼合，更易新骨的形成。該材料良好的機(jī)械屏障作用已經(jīng)得到認(rèn)可，但目前還未見(jiàn)該材料作為細(xì)胞載體用于牙周組織再生的有關(guān)報(bào)道。因此，如能將GTR中的屏障膜作為細(xì)胞載體，特別是與PDLSCs結(jié)合用于牙周組織工程和細(xì)胞治療中，定將加速臨床轉(zhuǎn)化的過(guò)程。本研究通過(guò)觀察PDLSCs在Bio－Gide膜材料上的生長(zhǎng)、粘附情況，證明該生物膜具有良好的生物相容性，無(wú)細(xì)胞毒性，能夠支持PDLSCs成膜性生長(zhǎng)，有望成為良好的牙周組織工程細(xì)胞載體材料。

［1］Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364(9429):149 －155.

［2］Bosshardt DD，Sculean A.Does periodontal tissue regeneration really work?［J］.Periodontol，2000，2009，51(1):208 －219.

［3］Bottino MC，Thomas V，Schmidt G，et al.Recent advances in the development of GTR/GBR membranes for periodontal regeneration－a materials perspective［J］.Dent Mater，2012，28(7):703－721.

［4］Tonetti MS，Cortellini P，Lang NP，et al.Clinical outcomes following treatment of human intrabony defects with GTR/bone replacement material or access flap alone.A multicenter randomized controlled clinical trial［J］.J Clin Periodonto，2004，31(9):770－776.

［5］Schwarz F，Bieling K，Latz T，et al.Healing of intrabony periimplantitis defects following application of a nanocrystalline hydroxyapatite(Ostim)or a bovine－derived xenograft(Bio－Oss)in combination with a collagen membrane(Bio－Gide).A case series［J］.J Clin Periodontol，2006，33(7):491 －499.

［6］Sculean A，Schwarz F，Chiantella GC，et al.Five－year results of a prospective，randomized，controlled study evaluating treatment of intra－bony defects with a natural bone mineral and GTR［J］.J Clin Periodontol，2007，34(1):72 －77.

［7］Chen FM，Sun HH，Lu H，et al.Stem cell－delivery therapeutics for periodontal tissue regeneration［J］.Biomaterials，2012，33，in press.

［8］張璟，楊昊，高麗娜，等.年齡因素對(duì)人牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)和性能的影響［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2012，22(3):136－140.

［9］Akizuki T，Oda S，Komaki M，et al.Application of periodontal ligament cell sheet for periodontal regeneration:a pilot study in beagle dogs［J］.J Periodontal Res，2005，40(3):245 －251.

［10］Liu Y，Zheng Y，Ding G，et al.Periodontal ligament stem cellmediated treatment for periodontitis in miniature swine［J］.Stem Cells，2008，26(4):1065 －1073.

［11］Ding G，Liu Y，Wang W，et al.Allogeneic periodontal ligament stem cell therapy for periodontitis in swine ［J］.Stem Cells，2010，28(10):1829－1838.