游荷花，沈敬華

（1.山西醫(yī)科大學(xué) 汾陽學(xué)院，山西 汾陽032200；2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010000）

Myo5a，染色體定位：15q21，是肌球蛋白重鏈12條（MYH12）。它是一種“摩托蛋白”，在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，屬于肌球蛋白家族中MyosinV中的一員，是依賴微絲運(yùn)動(dòng)參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)摹yo5a是此家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，為肌球蛋白提供了新的研究方向。最近的研究發(fā)現(xiàn)Myo5a可能與一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)［1］。為進(jìn)一步研究Myo5a與腫瘤的發(fā)生有無相關(guān)性，本研究構(gòu)建Myo5a特異性片段的原核表達(dá)重組質(zhì)粒PGEX－4T－3／Myo5a，并進(jìn)行了鑒定，以期為后續(xù)研究Myo5a的作用提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

Myo5aDNA模板，原核表達(dá)載體PGEX－4T－3，大腸桿菌菌株DH5α均來自本實(shí)驗(yàn)室。BamHⅠ、XhoⅠ等DNA限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶均由Takara公司提供。質(zhì)粒小量提取試劑盒，膠回收試劑盒均由AXYGEN公司提供。

1.2 設(shè)計(jì)引物并合成

根據(jù)GenBank的人類Myo5a基因全序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物來擴(kuò)增Myo5a羧基端第5077－5208堿基對(duì)長(zhǎng)131bp的小片斷。在上游引物PF的5′端添加BamHⅠ識(shí)別序列和保護(hù)序列，在下游引物PR的5′端添加XhoⅠ識(shí)別序列和保護(hù)序列。引物序列如下：

PF／BamH Ⅰ 5′－CG／GGATCC／ATGTTCTACATCATAGGG－3′

PR／XhoⅠ5′－CCG／CTCGAG／CAGATTCTTGTCACGCAG－3′

1.3 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增Myo5a特異性小片斷

在冰上將0.5μL的Myo5aDNA模板，2μL的引物，1μL的dNTP，0.5μL的 DNA 聚合酶（Vent酶），5μL的緩沖液，41μL的DI H20構(gòu)成50μL體系加入PCR管中。先95℃預(yù)變性2 min。然后95℃變性15s，50℃退火30s，72℃延伸45s，此三步循環(huán)30次。然后4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。得到所需擴(kuò)增片段后使用RCR純化試劑盒提純DNA。

1.4 克隆目的基因

將上述PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒載體PGEX－4T－3分別進(jìn)行BamH I和X ho I雙酶切，酶切后的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化；之后利用T4DNA連接酶在4℃過夜條件下將Myo5a基因小片段與質(zhì)粒載體PGEX－4T－3按一定比例相連接。取連接反應(yīng)液分別轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布菌液于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平皿上，37℃培養(yǎng)12～16h。

1.5 陽性重組質(zhì)粒的篩選與鑒定

1.5.1 PCR鑒定重組質(zhì)粒

從上述LB培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)菌落，之后分別接種含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，劇烈振搖培養(yǎng)37℃過夜。從各管中分別取菌液以PF、PR作為引物，直接PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，能擴(kuò)增出Myo5a基因片段者為陽性重組質(zhì)?？寺　?/p>

1.5.2 酶切鑒定重組質(zhì)粒

對(duì)經(jīng)PCR篩選、鑒定正確的陽性重組質(zhì)?？寺∮觅|(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，然后進(jìn)行BamH I和Xho I雙酶切，鑒定目的基因是否插入載體中，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 基因序列測(cè)定鑒定重組質(zhì)粒

北京諾塞基因組研究中心有限公司使用雙脫氧鏈終止法全自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)PCR鑒定及酶切鑒定均正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增Myo5a基因特異性片段

以人類Myo5a基因全序列為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致約131bp的DNA片段（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的篩選并鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

對(duì)LB平皿上隨機(jī)挑取的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，大部分?jǐn)U增出約131bp大小的DNA片段（圖2）。

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products expression

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the recombinant plasmid expression

2.2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

用BamH I和Xho I對(duì)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，可見約4900bp的大片段和約131 bp的目的片段。（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion identification of the recombinant plasmid expression

3 結(jié)論與討論

肌球蛋白V分子是“Y”字結(jié)構(gòu)，有兩條完全相同的重鏈。它由頭部、頸部、尾部3個(gè)功能部位組成。頸部較長(zhǎng)，尾部較短，每條重鏈頸部有3條調(diào)解輕鏈和3條必需輕鏈，而尾部頂端的位點(diǎn)可以和運(yùn)輸物質(zhì)相結(jié)合［2］。電鏡下看到提純的腦肌球蛋白Va的存在方式是雙頭聚合體［3］。MyosinV是“非傳統(tǒng)”的線性馬達(dá)，不同于其它線性馬達(dá)，它的頸部區(qū)域較長(zhǎng)大約24nm［4］，因而步子比較大。最近研究表明MyosinV類蛋白在無中間絲的情況下，運(yùn)動(dòng)“步伐”會(huì)變大、同時(shí)速度也會(huì)變快，提示中間絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)所形成的粘滯力有可能阻礙了細(xì)胞器間的運(yùn)輸［5］。

Provance等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老鼠的肌球蛋白V基因免疫缺陷時(shí)會(huì)表現(xiàn)表皮顏色變淡或?qū)a，此外，受影響的老鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)問題，幾周后就會(huì)死亡，認(rèn)為沖淡的表皮顏色是由于黑色素顆粒從黑色素細(xì)胞到發(fā)光毛發(fā)運(yùn)輸?shù)娜睋p所致［6～8］。這表明存在于色素細(xì)胞中的黑色素的運(yùn)輸與肌球蛋白V是有關(guān)的，肌球蛋白V沿著肌動(dòng)蛋白微絲連續(xù)運(yùn)動(dòng)，此過程利用的是水解ATP產(chǎn)生的自由能。也有研究證明人類“Griscelli病”是因?yàn)镸yosinV基因突變導(dǎo)致了輕色素沉著，共濟(jì)失調(diào)以及各種免疫缺陷和神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀［10］。肌球蛋白V在細(xì)胞內(nèi)主要負(fù)責(zé)有被小泡和黑色素等微粒的運(yùn)輸。當(dāng)這種馬達(dá)發(fā)生故障時(shí)就會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)或免疫等方面的疾?。?］。近幾年的研究又發(fā)現(xiàn)Myo5a可能與一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

本研究用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增出Myo5a基因特異性片段的蛋白編碼序列，經(jīng)BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切后，將此片段插入原核表達(dá)載體pGEX－4T－3，構(gòu)建重組子PGEX－4T－3／Myo5a。通過PCR、限制性酶切和基因測(cè)序3種方式證實(shí)獲得了原核重組載體PGEX－4T－3／Myo5a，不僅可以為后續(xù)研究Myo5a的作用提供研究工具，同時(shí)也可以為深入研究非常規(guī)肌球蛋白在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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