王秋榮，畢建功，林利民，王志勇

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361021)

青石斑魚Epinephelus awoara隸屬于鱸形目Perciformes、鮨科 Serranidae、石斑魚屬 Epinephelus，是一種暖水性近海底層名貴魚類，在中國主要產(chǎn)于南海和東海南部。其肉質(zhì)肥美鮮嫩，營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛，活魚運(yùn)銷港澳市場，被奉為上等佳肴，市場供不應(yīng)求。中國對青石斑魚人工繁殖技術(shù)、養(yǎng)殖模式、飼料營養(yǎng)、病害防治等方面的研究已取得了許多突破性的進(jìn)展［1-7］。中國南方青石斑魚的人工育苗規(guī)模逐年擴(kuò)大，但人工培育的苗種中常出現(xiàn)較高比例的畸形苗。由于骨骼畸形的個(gè)體生長緩慢、存活率低且因其外部形態(tài)怪異而影響其商品價(jià)值，一般不為養(yǎng)殖業(yè)者所接受，在苗種出售時(shí)還需花費(fèi)一定人力剔除畸形苗，這給該養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

國外早在20世紀(jì)90年代就開展了人工培育魚苗骨骼畸形的研究，主要研究對象有金頭鯛Sparus aurata L.、狼鱸 Dicentrarchus labrax L.、虱目魚Chanos chanos、真鯛Pagrus major、金槍魚Thunnus orientalis以及一些比目魚類的牙鲆Paralichtys olivaceus、大菱鲆 Scophthalmus maximus 等［8-15］。造成仔魚骨骼畸形的原因除了環(huán)境條件 (水流、溫度、鹽度、溶解氧等)及遺傳因子以外，還有飼料營養(yǎng)均衡的問題。骨骼系統(tǒng)發(fā)育是否正常是衡量魚苗質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一，如何防除苗種骨骼發(fā)育異常是魚類人工繁殖中必須解決的重要課題。通過研究魚類骨骼畸形的形態(tài)特征，并深入探究骨骼畸形的形成機(jī)制和原因，才能制定有效的防除對策，降低苗種的畸形率，提高苗種質(zhì)量。目前，有關(guān)石斑魚類骨骼發(fā)育及異常的研究資料極少，僅見Nagano等［16］對七帶石斑魚Epinephelus septemfasciatus骨骼發(fā)育及異常的研究報(bào)道。本研究中，作者對中國主要養(yǎng)殖石斑魚類青石斑魚的骨骼異常進(jìn)行形態(tài)觀察，旨在為青石斑魚骨骼發(fā)育的研究提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用青石斑魚幼魚由福建省水產(chǎn)研究所海水魚類試驗(yàn)場提供，挑選外形有明顯畸形的幼魚50尾 (體質(zhì)量為15～20 g)，用體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林溶液固定后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行標(biāo)本制作和觀察。

1.2 方法

1.2.1 透明標(biāo)本的制作 首先將用福爾馬林固定的青石斑魚幼魚用蒸餾水滴洗5～6 d后，直接置于軟骨染色液(10 mg阿利新藍(lán)8GX+80 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液+20 mL冰醋酸)浸泡處理24～48 h，至尾部骨骼出現(xiàn)濃青色為止。然后用95%的乙醇浸泡兩次，每次2～3 h，再分別用體積分?jǐn)?shù)為75%、40%、15%的乙醇各處理2～3 h，最后將標(biāo)本移入蒸餾水中放置24 h直到標(biāo)本下沉。經(jīng)蒸餾水浸泡后的標(biāo)本用胰蛋白酶溶液 ［30 mL飽和硼酸溶液+70 mL蒸餾水+1 mg胰蛋白酶 (1∶250，美國BD公司產(chǎn)品)］進(jìn)行去組織處理，每隔2～3 d，溶液呈藍(lán)色時(shí)及時(shí)更換胰蛋白酶溶液，反復(fù)直至幼魚骨骼清晰可見為止。將經(jīng)胰蛋白酶溶液處理后的標(biāo)本放入硬骨染色液 ［0.5%KOH溶液中直接加入少量茜素紅粉末進(jìn)行溶解，溶液呈濃紫色］中染色24～48 h，至脊椎骨染紅為止。然后將硬骨染色液換成0.5%KOH溶液，浸泡24～48 h，除去多余染色液。再依次換成 KOH-甘油溶液(3∶1，1∶1，1∶3)直到純甘油，各處理24～48 h，在最初的KOH-甘油溶液中每100 mL可加3～4滴3%的雙氧水去除魚體上的色素。制作完的標(biāo)本置于純甘油中并加少量百里酚粉末進(jìn)行密封保存。

1.2.2 透明標(biāo)本的觀察 使用數(shù)碼照相機(jī)對幼魚透明標(biāo)本進(jìn)行拍照，并仔細(xì)觀察幼魚骨骼畸形的部位和形態(tài)特征，最后進(jìn)行資料整理歸類。

2 結(jié)果

2.1 脊柱發(fā)育異常

青石斑魚脊柱由24節(jié)脊椎骨組成 (包括尾桿骨)，正常發(fā)育的脊柱如圖1-A，脊柱發(fā)育異常包括脊柱前凸 (圖1-B、C、E)、脊柱后凸 (圖1-D)和脊柱側(cè)凸 (圖1-E)以及椎骨的愈合 (圖1-F)、椎骨的變形 (圖1-G)。脊柱前凸的位置主要在第3～5節(jié)和第15～17節(jié)脊椎骨之間，脊柱向腹部方向凸出彎曲;脊柱后凸主要發(fā)生在第8～11節(jié)脊椎骨之間，脊柱向背部方向凸出彎曲;脊柱側(cè)凸部位發(fā)生在第20～21節(jié)椎骨之間，脊柱向側(cè)面方向凸出彎曲;椎骨的愈合出現(xiàn)在第12節(jié)與第13節(jié)椎骨發(fā)生愈合，椎骨的變形出現(xiàn)在第22塊脊柱骨向下凹陷。

2.2 臀鰭發(fā)育異常

正常發(fā)育的臀鰭如圖2-A所示，每根鰭條由對應(yīng)的遠(yuǎn)端支鰭骨和近端支鰭骨所支撐。本研究中觀察到青石斑魚臀鰭的畸形癥狀主要是近端支鰭骨的分叉 (圖2-B)，并未觀察到近端支鰭骨之間軟骨片的存在及近端支鰭骨的愈合等在其他魚類中出現(xiàn)過的畸形癥狀。

2.3 背鰭發(fā)育異常

正常發(fā)育的背鰭由鰭條、近端支鰭骨和遠(yuǎn)端支鰭骨組成 (圖3-A)。本研究中觀察到背鰭發(fā)育異常有兩種癥狀:近端支鰭骨之間有軟骨片存在(圖3-B);近端支鰭骨的末端發(fā)生分叉 (圖3-C、D)。

2.4 尾鰭骨發(fā)育異常

青石斑魚尾鰭骨骼由最后一節(jié)椎骨往上翹所形成尾桿骨及3枚尾上骨和5枚尾下骨組成 (圖4-A)。尾鰭骨發(fā)育異常主要表現(xiàn)在尾上骨數(shù)目不等(圖4-B、C)，比正常魚少一塊或兩塊尾上骨。

3 討論

本研究中首次報(bào)道青石斑魚骨骼發(fā)育異常的形態(tài)特征，主要觀察了脊柱、背鰭、臀鰭及尾鰭發(fā)育的畸形情況。青石斑魚脊柱的畸形癥狀主要有脊柱前凸、脊柱后凸、脊柱側(cè)凸以及椎骨的愈合和變形，與其他魚種相比較，青石斑魚脊柱的畸形情況較嚴(yán)重，癥狀多樣化。如七帶石斑魚的脊柱異常主要有脊柱前凸、脊柱后凸兩種癥狀［16］，真鯛、黑鯛Sparus macrocephlus、牙鲆等魚種脊柱異常主要有椎骨愈合和變形癥狀［14，17］。本研究中并未觀察到如在金槍魚和大西洋庸鰈Hippoglossus hippoglossus中出現(xiàn)的脊椎增生肥大及髓棘和脈棘的畸形癥狀［13，18］。青石斑魚背鰭的發(fā)育異常表現(xiàn)為近端支鰭骨的末端發(fā)生分叉及近端支鰭骨之間有軟骨片存在，這與在金槍魚上觀察到的癥狀相似，但并沒有觀察到如在真鯛中出現(xiàn)的遠(yuǎn)端支鰭骨缺損的癥狀［17］。青石斑魚臀鰭的異常只觀察到近端支鰭骨的分叉，并沒有觀察到近端支鰭骨之間軟骨片的存在，近端支鰭骨的愈合，臀鰭基部陷入，以及遠(yuǎn)端鰭骨的缺損等在其他魚類中出現(xiàn)的癥狀［13］。青石斑魚尾鰭骨發(fā)育異常主要表現(xiàn)在尾上骨數(shù)目不等，未觀察到如在真鯛中出現(xiàn)的尾骨短小和肥大的癥狀以及在黑鯛中出現(xiàn)的尾骨之間有軟骨片出現(xiàn)的癥狀［17］。由此可見，不同魚種其骨骼系統(tǒng)出現(xiàn)異常所表現(xiàn)的癥狀有所差異，這可能受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)條件等不同因素的影響所致［19-20］。由于本研究中采集的標(biāo)本個(gè)體較大，制作透明標(biāo)本難度較大，特別是頭部骨骼沒有處理好，因此，本研究中未對青石斑魚頭部骨骼進(jìn)行觀察，頭部骨骼是否有異常還有待于今后進(jìn)一步研究。

圖1 青石斑魚正常脊柱與畸形脊柱Fig.1 Normal and malformed vertebral column of yellow grouper Epinephelus awoara

圖2 青石斑魚正常臀鰭與畸形臀鰭Fig.2 Normal and malformed anal fin of yellow grouper Epinephelus awoara

在魚類人工繁殖過程中，影響魚類骨骼發(fā)育異常的因素較多，如水流、光照、水溫、細(xì)菌感染、營養(yǎng)狀況等。對真鯛和狼鱸的研究表明，脊柱前凸主要與仔魚的開鰾率有關(guān)［10］。金槍魚吻部的骨骼畸形主要是因其受應(yīng)激時(shí)沖撞水槽壁所致［13］。Kanazawa等［21］研究表明，飼料中添加磷脂可以降低香魚仔魚下頜和脊椎的畸形率，另一方面，用n-3 HUFA強(qiáng)化劑強(qiáng)化生物餌料可以減少七帶石斑魚的骨骼畸形［16］。飼料中過剩的維生素D會(huì)引起牙鲆脊柱畸形和狼鱸頭部骨骼畸形［22-23］。本研究中，試驗(yàn)魚是從室內(nèi)人工培育的苗種中挑選出來的，在取樣過程中發(fā)現(xiàn)，由同一批受精卵孵化的魚苗，放在不同的育苗池培育，其魚苗的畸形率差別也很大，且骨骼畸形率高的苗池往往成活率較低。由此作者認(rèn)為，由遺傳因素導(dǎo)致骨骼畸形的可能性較小，培育條件不適或餌料營養(yǎng)缺陷可能是誘導(dǎo)骨骼畸形的主要原因。骨骼畸形會(huì)影響魚的攝食和游泳能力，進(jìn)而導(dǎo)致魚苗體質(zhì)變?nèi)?，生長變緩，抵抗病害和逃避同類相殘的能力下降，造成育苗成活率低下。本研究中只對青石斑魚骨骼異常的形態(tài)特征進(jìn)行描述，并未對仔稚魚培育過程中骨骼的發(fā)育進(jìn)行全程跟蹤觀察，對于產(chǎn)生各種骨骼畸形的具體原因尚不清楚，還有待今后進(jìn)一步研究。

圖3 青石斑魚正常背鰭與畸形背鰭Fig.3 Normal and malformed dorsal fin of yellow grouper Epinephelus awoara

圖4 青石斑魚正常尾鰭與畸形尾鰭Fig.4 Normal and malformed caudal fin of yellow grouper Epinephelus awoara

［1］陳波，羅海忠，付榮兵.青石斑魚生物學(xué)特性及其人工繁殖技術(shù)［J］.河北漁業(yè)，2006(2):48-53.

［2］王紅勇，吳洪流，馮永勤，等.青石斑魚池塘養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)［J］.科學(xué)養(yǎng)魚，2003(12):24-36.

［3］陳學(xué)豪，胡家財(cái)，周立紅.青石斑魚配合餌料中脂肪節(jié)約蛋白質(zhì)效應(yīng)的初步研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1996，18(1):21-24.

［4］周立紅，胡家財(cái)，陳學(xué)豪.青石斑魚人工配合餌料中脂肪適宜含量的研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1995，17(2):13-16.

［5］胡家財(cái)，周立紅，洪惠馨.青石斑魚人工配合餌料中蛋白質(zhì)適宜含量的研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1995，17(2):8-12.

［6］朱傳華，何建國，黃志堅(jiān).網(wǎng)箱養(yǎng)殖石斑魚暴發(fā)性潰瘍病病原菌分離、鑒定及致病性研究［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000(S1):278-282.

［7］劉秀珍，李家炳.海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖石斑魚病原菌研究［J］.熱帶海洋，1994(1):81-86.

［8］Andrades J，Becerra J，F(xiàn)ernandez-Llebrez P.Skeletal deformities in larval，juvenile and adult stages of cultured gilthead sea bream Sparus aurata L.［J］.Aquaculture，1996，141:1-11.

［9］Koumoundouros G，Divanach P，Kentouri M.Osteological development of the vertebral column and of the caudal complex in Dentex dentex［J］.Journal of Fish Biology，1994，54:424-436.

［10］Chatain B.Abnormal swimbladder development and lordosis in sea bass Dicentrarchus labrax and sea bream Sparus aurata［J］.Aquaculture，1996，119:371-379.

［11］Hilomen-Garcia G V.Morphological abnormalities in hatcherybred milkfish Chanos chanos Forsskal fry and juveniles［J］.Aquaculture，1997，152:155-166.

［12］Matsuoka M.Osteological development in the red sea bream，Pagrus major［J］.Japan J Ichthyol，1985，32(1):35-51.

［13］Shimizu H，Takeuchi H.Bone abnormality of hatchery-reared bluefin tuna Thunnus orientalis［J］.Suisanzoshoku，2002，50(1):71-78.

［14］Haga Y，Takeuchi T，Seikai T.Influence of alltrans retinoic acid on pigmentation and skeletal formation in larval Jananese flounder［J］.Fisheries Science，2002，68:560-570.

［15］Wagemans F，F(xiàn)ocant B，Vandewalle P.Early development of the cephalic skeleton in the turbot［J］.Journal of Fish Biology，1998，52:166-204.

［16］Nagano N，Hozawa A，F(xiàn)ujik W，et al.Skeletal development and deformities in cultured larval and juvenile seven-band grouper，Epinephelus septemfasciatus(Thunberg)［J］.Aquaculture Research，2007，38:121-130.

［17］Matsuoka M.Development of the skeletal tissue and skeletal muscle in the red sea bream，Pagrus major［J］.Seikai Bull Seikai Reg Fish Res Lab，1987，65:1-114.

［18］Leah M L，Santosh P L.Development of the axial skeleton and skeletal abnormalities of Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus from first feeding through metamorphosis［J］.Aquaculture，2006，257:124-135.

［19］Cahu C，Infante J Z，Takeuchi T.Nutritional components affecting skeletal development in fish larvae［J］.Aquaculture，2003，227:245-258.

［20］Koumoundouros G，Divanach P，Kentouri M.The effect of rearing conditions on development of saddleback syndrome and caudal fin deformities in Dicentrarchus labrax(L.)［J］.Aquaculture，2001，200:285-304.

［21］Kanazawa A，Teshima S，Inamori S，et al.Effect of phospholipids on growth，survival rate，and incidence of malformation in larval ayu［J］.Memories of the Faculty of Fisheries，Kagoshima University，1981，30:301-309.

［22］Takeuchi T，Dedi J，Haga Y，et al.Effect of vitamin A compounds on bone deformity in larval Japanese flounder Paralichthys olivaceus［J］.Aquaculture，1998，169:155-165.

［23］Villeneuve L，Gisbert E，Le Delliou H，et al.Dietary levels of alltrans retinol affect retinoid nuclear receptor expression and skeletal development in European sea bass larvae［J］.British Journal of Nutrition，2005，93:791-801.